1er symposium international d’Allergologie Moléculaire - Rome - 4ème partie

dimanche 9 avril 2006 par Dr Hervé Couteaux2622 visites

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1er symposium international d’Allergologie Moléculaire - Rome - 4ème partie

1er symposium international d’Allergologie Moléculaire - Rome - 4ème partie

dimanche 9 avril 2006, par Dr Hervé Couteaux

Session N° 4 : Allergènes - Diagnostic et épidémiologie.
Jonas Lidholm, directeur de la recherche du laboratoire Phadia, ex-Pharmacia, était sans doute bien placé pour nous parler des tests IgE, enfin, surtout de leurs avantages : c’est exactement ce qu’il a fait.

Comment parler diagnostic sans parler des microarrays et autres chips d’allergènes ? Inenvisageable en 2006 : Reinhard Hiller en a parlé.

La personnalité de Jorg Kleine-Tebbe et le sujet qu’il avait choisi (des molécules simples dans le labo d’allergologie ?) formaient un mélange détonnant qui a subjugué l’audience : non seulement c’est possible, mais c’est arrivé !

Le symposium ne pouvait se terminer sans un exposé d’Adriano Mari, se demandant (sincèrement ?) si ces molécules allergéniques, c’était bien tout ce dont avait besoin un allergologue, dans un exposé d’une concision extrême...}

Allergènes définis dans les tests d’IgE spécifiques - avantages et possibilités.

Jonas Lidholm, Suède.

Les allergènes, on les respire, on les mange et on vit avec eux, mais les sources allergéniques sont différentes des molécules allergéniques.

Le diagnostic basé sur les IgE fait appel aux allergènes naturels ou aux recombinants :

Allergène naturel purifié :
 Qualités :

  • Authenticité structurale.
  • Représentation d’isoformes.
  • Au départ plus rapides et moins coûteux.

 Inconvénients :

  • Le rendement est souvent faible.
  • Il y a des variations du matériel brut, à la fois biologique et génétique.
  • Contamination possible par d’autres allergènes de la même source.

Allergènes recombinants :
 Qualités :

  • Haut rendement, sans rapport avec l’abondance de l’allergène dans sa source naturelle.
  • Pas de variation du matériel brut.
  • Hautement reproductibles, process contrôlables.
  • Pureté absolue vis-à-vis d’autres allergènes.

 Inconvénients :

  • Pas de modification post-translationnelle (ou limitée) ; par exemple pour les CCDs.

Production d’allergènes recombinants :
 La courbe de croissance pendant la fermentation comprend plusieurs phases : temps de latence, phase logarithmique, puis induction et récolte.
 Enfin, vérification de l’activité.

De combien d’allergènes avons-nous besoin ? Moins qu’on ne le pense.

Par exemple, pas de différence entre Phleum et Lolium.
 Si on regarde la pertinence rPhl p 1, rPhl p 5 versus extrait brut, on a une très bonne corrélation linéaire.
 Même chose pour rBet v 1 versus extrait de pollen de bouleau.
 Par contre, les IgE se lient avec les 9 membres des PR-10 ; et on peut constater que carotte et céleri sont différents.

Eléments rationnels pour le choix d’un panel rationnel d’allergènes de demain :
 Oublier les espèces (avec raison).
 Penser bases de données (PFAM), penser structures (avec prudence).
 Contrôler la redondance soigneusement (en se basant sur des preuves).

Quelle aide peut nous apporter les recombinants ?

Sensibilisation n’est pas allergie :
 Les tests IgE spécifiques mesurent la sensibilisation.
 La sensibilisation est le facteur de risque le plus puissant pour la survenue d’une allergie, mais...
 A tout moment donné la sensibilisation peut être présente sans symptômes.
 La sensibilisation précède la maladie allergique manifeste.
 La réaction croisée sérologique est fréquemment, mais pas toujours accompagnée par une allergie croisée (signes cliniques).

Dans le schéma général :
 Exposition et terrain atopique - sensibilisation
 Exposition et autres facteurs (réactivité cellulaire, réactivité des organes, magnitude de la sensibilisation, autres allergènes et charge allergénique totale, génétique, temps) - allergie
 Il ne faut surtout pas oublier la DOSE d’exposition.

Que faut-il attendre d’un test IgE spécifique ?
 Détection et quantification d’IgE spécifiques de l’allergène quand il y en a : c’est la sensibilité.
 Donner un résultat négatif en l’absence d’IgE spécifique : c’est la spécificité (pas de liaison IgE non spécifique, de spécificité isotypique, tolérance à haut niveau d’IgE totales, pas de contamination croisée d’allergènes, etc.)

La spécificité clinique est différente :
 L’accord entre les IgE spécifiques et les symptômes cliniques est une question de pathobiologie et non une propriété du test IgE en tant que tel.
 La spécificité clinique peut être augmentée par la détection d’informations partielles sur les IgE spécifiques (composants spécifiques de l’allergène, peptides) et par une mesure quantitative appropriée des IgE.
 Si vous ajoutez Cor a 1 à un extrait de noisette, vous allez détecter des choses non pertinentes en Espagne, par exemple.

Trois manières d’utiliser des allergènes recombinants dans des tests IgE :
 Manière N°1 : Comme additif à un extrait :

  • Pour contrecarrer un déficit d’un allergène particulier.
  • Pour améliorer la sensibilité.
  • Pour augmenter les performances quantitatives.

 Manière N°2 : En remplacement d’un extrait :

  • Pour assurer une saturation pour chaque allergène du mélange initial.
  • Comme sélection de molécules informatives.
  • Pour négliger des composants redondants.
  • Pour avoir une composition du réactif complètement définie et conçue.

 Manière N°3 : En tant qu’allergènes simples pour l’analyse de sous populations d’IgE.

  • Pour des recommandations d’éviction spécifiques.
  • Pour des corrélations à des risques particuliers ou à des conditions cliniques particulières.
  • Pour rechercher un agent sensibilisant primaire et une sélection adéquate d’une immunothérapie.

Exemple de la cerise : étude de 2 échantillons de sujets d’origine géographique différente.
(Publication en attente : Clin Exp Allergy.)

Lieu% Pru av 1 +% Pru av 3 +% Pru av 4% Broméline +
ES (n=22) 5% 91% 9% 9%
DE +CH (n=121) 96% 11% 18% 26%

Les microarrays d’allergènes comportent des allergènes bien définis et sensibles.

Question de la salle :
 La sensibilisation, c’est la présence d’IgE ?

  • Oui, il n’y a pas de valeur seuil. Si on détecte des IgE, il y a sensibilisation.
  • Plus le niveau d’IgE est élevé, plus la probabilité d’avoir des signes cliniques est élevée. Pour des valeurs faibles, on n’a pas d’idée de cette probabilité.

Tester les allergènes au moyen des microarrays.

Reinhard Hiller, Autriche.

ISAC : Immuno Solid-phase Allergen Chip (VBC-Genomia).

Cette technologie sous entend :
 Un substrat adéquat
 Une modification de la surface
 Immobilisation des protéines par spotting (basée sur l’utilisation de piézo)
 Analyse, détection.

 On a besoin de seulement 20µl en raison de la miniaturisation.
 La détection se fait par fluorescence.
 Pour les protéines, il existe plusieurs utilisations : diabète, auto-immunité, détection de drogues, mapping d’épitopes, etc.
 37 sources d’allergènes sont utilisées.
 76 protéines allergéniques, naturelles ou recombinantes.
 3 heures d’incubation et 10 minutes de lecture.
 Résultats en fluorescence après étalonnage.
 Les résultats se présentent sous la forme d’une liste d’allergènes auxquels le patient réagit (3 degrés : normal, modéré, élevé).
 C’est une méthode quantitative, pas seulement oui-non.
 Les résultats peuvent être exprimés en kU.

 Pour l’utilisation en clinique, il faudra connaître la sensibilité et la spécificité.
 Cela pourra notamment servir pour les réactions croisées : on saura quel est l’allergène immuno-dominant par test d’inhibition : Chip-based competitive assay (Analyse compétitive basée sur chip).

Il restera à corréler les données accumulées sur les allergènes et les données cliniques.

Conclusion :
 Amélioration du diagnostic par l’identification des panels d’allergènes pertinents.
 Outil bioinformatique puissant pour l’analyse de données.
 Système de support de décision pour un diagnostic amélioré.
 Bases de données intégrées pour des extractions de données efficientes. (Allergome ?...)


Des molécules simples dans le laboratoire d’allergie : indices excitants ou droits exorbitants ?

Jorg Kleine-Tebbe, Allemagne.

Les valeurs des IgE spécifiques : quantitatives, semi quantitatives, ou qualitatives ?

Si on trace la courbe de distribution des dosages d’IgE, on obtient une courbe de Gauss.
 Là-dessus, on utilise des classes
 On peut aussi se contenter de positif négatif.

 De hautes valeurs d’IgE spécifiques sont elles le témoin d’une forte sensibilisation ?
 Comment est la relation entre les IgE totales et les IgE spécifiques ?

  • Ex 1 : IgE spécifiques hautes et IgE totales très élevées : Les IgE spécifiques sont basses par rapport aux IgE totales !
  • Ex 2 : IgE spécifiques basses et IgE totales très basses : on a des IgE Spécifiques élevées par rapport aux IgE totales !

La probabilité de survenue de réactions cliniques augmente avec les niveaux individuels d’IgE spécifiques : ce sont les fameux seuils de Sampson (JACI, 2001) :

 Au delà de 15 kU/l pour le lait de vache, on prédirait la survenue de réactions clinique avec une probabilité de 95%.
 20 kU/l pour le poisson
 14 kU/l pour l’arachide
 7 kU/l pour l’œuf

Si on fait des tests de provocation pour chaque allergène en essayant de vérifier ça, on retrouve un résultat différent pour un allergène (12.6 pour l’œuf) et rien du tout pour les 3 autres (étude de Célik-Bilgili S., Niggeman B. et al. Clin Exp. Allergy 2005 ; 35 : 268-73).

Pourquoi ? Parce que la prévalence détermine la prédiction !

Exemple 1 :

Réaction cliniqueIgE spécifique positiveIgE spécifique négative
Réaction clin. Positive 90 10
Réaction clin. Négative 10 90

 Sensibilité : 90%
 Spécificité : 90%
 VPP (valeur prédictive positive) : 90%
 VPN : 90%
 W : 50% prévalence.

Ex 2 :

Réaction cliniqueIgE spécifique positiveIgE spécifique négative
Réaction clin. Positive 9 1
Réaction clin. Négative 10 90

 Sensibilité : 90%
 Spécificité : 90%
 VPP (valeur prédictive positive) : 47%, on a un résultat très différent...
 VPN : 99%
 W : 10% prévalence.

 On retrouve la même chose avec les molécules :
 Veut-on un diagnostic précis ou large (chips) ?
 Avec l’exemple des profilines, se pose le problème de la pertinence clinique.

Distribution des panallergènes d’après www.allergen.org (20 Février 2006) :

Référence allergène12345678910Source
Bet v Bet v 1-hom. Profiline 3 Ca++BP 5 6 7 - - - Pollen Bouleau
Cor a Bet v 1-hom. Profiline 3 4 5 6 7 LTP - - Pollen Noisetier
Art v 1 2 LTP Profiline 5 6 - - - - Pollen Armoise
Mal d Bet v 1-hom. Thaumatine-like LTP Profiline - - - - - - Pomme
Cor a Bet v 1-hom. Profiline - - - - - 8 - - Noisette
Pru av Bet v 1-hom. Thaumatine-like LTP Profiline - - - - - - Cerise
Ara h 1 2 3 4 Profiline 6 7 8 - - Arachide
Gly m 1 2 3 4 - - - - - - Soja
Api g Bet v 1-hom. - - Profiline 5 - - - - - Céleri
Ole e 1 Profiline 3 4 5 6 7 Ca++BP 9 10 Pollen Olivier

 Que fait-on de toutes ces données ? Il faut des nouveaux algorithmes !
 Certains pourraient dire : cela nous est égal, nous, on teste avec des fruits frais...C’est mieux, non ? Oui, mais alors, on ne saura jamais si c’est une profiline ou une LTP qui est en cause.

Exemple de la pomme : un test positif à la pomme native recouvre 3 situations différentes :
 Profiline
 PR-10
 PR-14 = LTP

A l’inverse, si on teste avec les molécules directement, on ne saura pas si le sujet réagit à la noisette ou à autre chose...

Par exemple, si on a une réponse positive avec du PR-10, cela peut relever de plusieurs sources d’allergènes possibles : noisette, pomme ou soja.

Autre test possible l’histamine release :
 Mais il y a une variabilité individuelle énorme, allergène dépendante.
 Si on recherche une sensibilité, avec 30% d’histamine release (ça a été fait avec Bet v 1) on n’obtient aucune corrélation.

Les tests cellulaires sont complexes et dépendent de plusieurs facteurs :
 Caractéristiques des allergènes spécifiques.
 Nombre de récepteurs cellulaires Fc epsilonRI
 Proportion d’IgE spécifiques.
 Réactivité cellulaire des basophiles (nombre de molécules IgE pour obtenir 50% de la réponse cellulaire maximale).

Perspectives :
 Molécules simples pour un diagnostic d’allergie ?
 Sensibilité augmentée, extraits améliorés, définition de molécules à risque et de profils à risque.

Diagnostic (à résolution) moléculaire : Component Resolved diagnostic (CRD) ?
 Jusqu’à présent, pas d’études cliniques pour l’utilisation du CRD en vue d’une immunothérapie (indication, prédiction, contrôle de l’efficacité).

Traitement moléculaire : Component Resolved Therapy (CRT) ?
 Jusqu’à présent aucune molécule simple n’a été approuvée pour l’immunothérapie.
 Pas d’étude sur l’approche du CRT.

Conclusion :
 Chaque test diagnostic d’allergie requiert une interprétation soigneuse sous l’angle de sa pertinence clinique.
 La sensibilisation allergique est différente de l’allergie, mais indique un risque d’allergie.
 L’allergie cliniquement pertinente existe seulement en cas de symptômes correspondants.
 L’histoire clinique fournit une probabilité d’allergie.
 Les tests cutanés ou tests IgE indiquent la sensibilisation.
 Les tests de provocation établissent la pertinence clinique.


Des molécules d’allergènes : est ce tout ce dont a besoin un allergologue ?

Adriano Mari, Italie.

Plan de l’exposé :
 Fiabilité des tests d’allergie.
 Ontologie de l’allergène
 Regrouper des critères
 Disponibilité des allergènes pour les tests
 Singleplex ou multiplex
 Coûts abordables
 Immunothérapie, extraits et molécules

Fiabilité des tests d’allergie :
 Depuis 1908, les tests cutanés n’ont pas vraiment changé.
 Si on compare avec les dosages d’IgE, ces derniers comportent beaucoup plus de contrôle, d’automatisation.
 Un système de soin devrait être : (D’après le Committee on Quality of Health Care in America, Institute of Medicine. Editorial Ann.Allergy Asthma Immunol.2006)

  • Sûr
  • Efficace
  • Opportun
  • Centré sur le patient
  • Efficient
  • Équitable

Les tests cutanés ne satisfont à aucun de ces critères.

Ontologie de la molécule allergénique :
 On a besoin de critères pour retenir une molécule dans une base de données.

Base de donnéesTotalAllergènesIsoallergènes
Allergome 1569 1198 371
IUIS 801 486 315

Regrouper des critères :
 Alt a 1 a beaucoup d’homologues.
 Une homologie de séquence aboutit à une co-reconnaissance par les IgE.
 Sur le site Allergome, visionner les profils d’homologie de séquence par les O-rings (ces graphes sont un moyen de représenter des relations complexes) donne une idée de la complexité des connaissances dans ce domaine.

Disponibilité des allergènes, singleplex et multiplex :
 Un microarray, c’est comme tester un patient avec 6 bras !...

Coûts :
 C’est une des raisons de la persistance des tests cutanés : le coût est faible.
 Si vous utilisez des molécules et/ou des recombinants, ça augmente les coûts...

Immunothérapie, extraits et molécules :
 Il FAUT une étiquette sur les flacons, avec le contenu !!!

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