Allergènes recombinants des acariens pour le diagnostic et l’immunothérapie des patients allergiques aux acariens.

Susanne Vrtala, Autriche.

50% des allergiques et 80% des enfants asthmatiques sont sensibles aux acariens.
Les allergènes des acariens sont complexes.

Groupe	Fonction biochimique	Poids moléculaire c DNA(SDS-PAGE)	Espèces	Fréq. de liaison IgE
1	Cystéin protéase	25	Dp, Df, Dm, Ds, Em	80-100
2	inconnue(HE1 homologue)	14	Dp, Df, Ds, Em, Ld, Tp, Gd, As	80-100
3	Trypsin	25-30	Dp, Df, Ds, Em	16-100
4	alpha-amylase	57	Dp, Dm	40-46
5	Inconnue	15	Dp, Bt, Ld	50-70
6	Chymotrypsin	25	Dp, Df	40
7	Inconnue	25(31, 29, 26)	Dp, Df, Ld	50
8	Glutathione S transferase	26	Dp	40
9	Collagenolytic serine protease	no cDNA(30)	Dp	90
10	Tropomyosin	37	Dp, Df	50-95
11	Paramyosin	96(92-98)	Df, Bt	80
12	Inconnue	14	Bt	50
13	Acide gras-binding Protein	15	Bt, Ld, As	10-23
14	Vitellogenin/apolipophorin-like	177(variable)	Dp, Df, Em	90
15	98 Chitinase	62,5(98-105)	Df	70
16	Gelsolin	55	Df	35
17	Ca-binding EF protein	30	Df	35
18	Chitinase	60	Df	60
19	Anti-microbial peptide	7	Bt	10

Les patients sont sensibles à divers allergènes dont certains ne sont pas encore connus.

Isolation et caractérisation des allergènes Der p ont permis d’obtenir une librairie cDNA.

Avec cette méthode, on a produit des recombinants Der p 2, 5, 7 et 10.

rDer p 5 a montré 32% d’IgE réactivité, avec des homologies avec Blo t 5, Lep d 5 et Der p 5, bien sûr.

En dépit de cette homologie, pas de réactivité croisée entre l’allergène 25 et Der p 5.

L’allergène dérivé du clone 25 est spécifique des acariens de la poussière de maison.

On peut l’utiliser pour le diagnostic : Il contient l’épitope IgE majeur des isoformes naturels.

Profil de réactivité avec les allergènes Der p en France, Autriche, Italie et Suède :

Der p	% IgE France	% IgE Autriche	% IgE Italie	% IgE Suède
Der p 1	100%	91%	96%	85%
Der p 2	91%	91%	98%	63%
Der p 4	45%	34%	30%	26%
Der p 5	64%	46%	43%	23%
Der p 7	24%	32%	46%	17%
Der p 8	9%	13%	16%	11%
Der p 10	9%	18%	10%	16%
Der p 14	0%	0%	3%	2%

Une combinaison de Der p 1 et Der p 2 permet cependant de diagnostiquer presque tous les patients allergiques aux acariens.

Ce recombinant, peut être utilisé pour l’ITS.

On peut aussi modifier l’allergène dans le sens d’une réactivité IgE diminuée.

rDer p 2 hybride n’a plus de liaison IgE du tout.

Les dérivés de rDer p 2 induisent une synthèse d’IgG qui inhibent les liaisons IgE-Der p 2.

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Evaluation de l’activité des allergènes recombinants in vivo.

Gabrielle Pauli, France.

Les allergènes peuvent être obtenus à partir de plusieurs sources :

• Sources biologiques.
• Extraits allergéniques pour le diagnostic.
• Molécules allergéniques naturelles purifiées.
• Allergènes recombinants.

Il y a eu peu de changements au 20ème siècle ; peut-être au 21è ?...

Les allergènes recombinants ont plusieurs avantages :

• Les recombinants nous offrent l’opportunité de surmonter de nombreuses difficultés présentées par les extraits naturels.
• Ils peuvent représenter des allergènes labiles, peu présents dans les extraits.
• On peut éviter une possible contamination.
• On exclut le risque inhérent aux agents infectieux.
  Ils permettent d’avoir des préparations d’une qualité pharmaceutique conforme :
• En effet les allergènes d’acariens dans les extraits varient d’un facteur supérieur à 500 fois (Thomas).
• Phl p 2, un allergène majeur des Poaceae, peut varier de 10 à 500 nanog/ml (Valenta).
• Alt a 1 peut varier de 0.05 à 2.75µg/ml (Esch).

Les recombinants, c’est donc la garantie d’avoir des doses connues d’allergènes.

Inclusion des seules protéines qui sont pertinentes.

• Avec les recombinants, on évite le problème de la standardisation des extraits.
• On peut aussi avoir une thérapie ciblée pour des patients ayant des spectres différents d’allergènes.

Allergènes naturels versus allergènes recombinants :

• La purification des allergènes naturels rencontre plusieurs problèmes :
  • Disponibilité réduite de la source biologique.
  • Rendement faible du processus d’isolation.

La comparaison des activités biologiques des allergènes naturels et recombinants est nécessaire et doit prendre en compte que :

• La glycosylation et le polymorphisme sont des caractéristiques communes des allergènes naturels.
• De nombreux variants sont trouvés dans les allergènes naturels, au contraire des recombinants qui correspondent à une forme simple homogène.

Comparer les activités biologiques des allergènes naturels et recombinants est un pré requis pour la validation de versions recombinantes d’allergènes inhalés, alimentaires ou d’insectes :

• A la fois par des techniques in vitro comme des études portant sur le RAST, le RAST inhibition, l’Immunoblot et l’histamine release.
• Et des techniques in vivo comme les tests cutanés et les tests de provocation par voie nasale, conjonctivale et bronchique.

Schmid-Grendelmeier P.et al., Int Arch Allergy Immunol 2001 :

• Compilation de 25 études publiées : 1600 sujets ont été testés avec 21 allergènes recombinants différents (pollens, acariens, moisissures, venins, latex, céleri,...)
• Le nombre de sujets testés était variable selon l’allergène (plus de 300 pour rBet v 1, 33 pour rOle e 1).
• Spécificité : 100% (diagnostic positif établi avec un extrait natif).
• Sensibilité : variable, dépendant de la prévalence des sensibilisations aux allergènes recombinants.
• Les Prick ont été réalisés avec des concentrations allant de 1 à 100µg/ml, le plus souvent 10µg/ml.
• Les IDR ont été réalisées avec des concentrations s’étalant de 0.01 à 10µg/ml.

Pour les techniques in vitro, on a comparé les réponses à l’IDR et les taux d’IgE spécif. de rBet v 1. Sans retrouver de corrélation.(r = - 0.007 ; p = 0.977) ( A.Purohit, S.Laffer, C.Metz-Favre, A.Vérot, F.Kricek, R.Valenta, G.Pauli ; Clin Exp Allergy 2005).

Pour les tests de provocation avec des recombinants :

• Tests de provocation nasale :
  • Bet v 1 : J.Godnic, Cvar et al. JACI 1997. 10 patients, rBet v 1-nBet v 1 : 5 réponses identiques, 4 moins importantes et une plus forte.
  • Bos d 2 : Ruoppi et al., Clin Exp Allergy 2001. 10 patients, nBos d 2-rBos d 2 : 9/10 ont réagi à rBos d 2, 10/10 ont réagi à nBos d 2.
• Tests de provocation conjonctivaux :
  • rBet v 1a (Arqvist) : 38/48 ont réagi à rBet v 1a à 10µg/ml.
• Tests de provocation bronchique :
  • Bet v 1 : J.Godnic, Cvar et al., JACI 1997, 10 patients rBet v 1-nBet v 1 ; 7/10 ont eu la même réaction, et 3/10 ont réagi plus fortement à rBet v 1.
    Pas de réactions pour les sujets contrôles.
    Pas d’effet secondaire noté.
• Pour les tests cutanés :
  • L’analyse de la liaison IgE de rFra e 1 et nFra e 1 sur 72 sera de patients de Strasbourg sensibilisés au pollen de Frêne retrouve une relation quasi linéaire (Ann Allergy Asthma Immunol 2006).
  • On a donc retrouvé les mêmes résultats avec le recombinant qu’avec l’extrait brut : C’est utile car le Frêne pollinise en même temps que le bouleau.

• Prédiction de la pertinence clinique : ex de la cerise : Balmer-Weber et al. JACI 2002.
  • N = 79 (24 sans allergie à la cerise)
  • La VPP pour la sensibilisation à la cerise est excellente avec rPru av 1, 3 et 4.
  • Mais elle est faible pour la détection des sujets allergiques à la cerise parmi les sujets sensibilisés au pollen de bouleau.

Quand on utilise des fragments (ou trimers) on doit augmenter la concentration pour avoir une réponse identique aux SPT.

Les études in vivo d’évaluation des hypoallergènes par engineerie peuvent aussi inclure des « Skin blister model » :

• après 2 heures d’incubation, on récolte des blisters et on dose l’histamine, l’ECP, le GM-CSF.
• Après 8 heures, leucocytes : éosinophiles, cytométrie de flux.

Une étude sur rBet v 1 et Mal d 1 :

• A la fin de l’ITS, les patients supportaient l’ingestion d’une plus grande quantité de pomme.

La validation des recombinants est nécessaire en 2006, elle apportera une évaluation des spectrotypes d’IgE des patients sensibilisés aux extraits natifs et une meilleure identification des réactivités croisées grâce aux répertoires de familles moléculaires.

Evolutions et perspectives :

• Améliorations diagnostiques : tests cutanés et de provocation (impliquant une meilleure connaissance clinique de l’importance potentielle de la sensibilisation).
• Améliorations de l’immunothérapie : allergènes recombinants (rBet v 1, en cours) et molécules recombinantes modifiées.

Mais il restera nécessaire de prouver l’efficacité par des études cliniques appropriées.

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Adjuvants des vaccins recombinants de l’allergie.

Philippe Moingeon, France. (Stallergènes, recherche et développement).

Les recombinants sont peu immunogéniques.

Adjuvant = toute approche permettant d’améliorer l’immunogénicité.

Étude VO34 de phase III chez 630 patients allergiques au pollen.

• Efficacité constatée sur score clinique et score médicamenteux.

Il n’y a pas d’absorption directe avec passage sanguin.

• Dans la voie sublinguale, les protéines sont captées par les cellules de Langerhans (ces cellules expriment des récepteurs à IgE) et transportées vers les ganglions.
• Cette immunisation locale entraîne une réponse systémique.

Travailler avec les recombinants, c’est vouloir ressembler au plus près à l’allergène naturel.

rBet v 1, c’est un allergène majeur impliqué dans plus de 90% d’allergies au pollen de bouleau.

• Il s’agit d’une PR-protéine (pathogenesis-related protein) intracellulaire, avec une activité de ribonucléase et de transport des stéroïdes des plantes.
• L’étude présentée ici concerne la production par E.coli d’une catégorie de produit pharmaceutique testée chez l’homme (phase III).

Pour ce qui concerne la polarisation de la réponse cellulaire T, on n’a pas de preuve d’induction de cellules T fonctionnelles, mais juste la mise en évidence d’IL-10.

Dans des travaux menés avec rDer p 1(produit par plant de tabac) et rDer p 2 (produit par E.coli) on a cherché des signaux de transduction des cellules immunes (induction d’IL-10 et de TGF béta) résultant de la polarisation des cellules dendritiques.

Deux adjuvants ont été testés Lactobacillus plantarum qui induit justement la maturation des cellules dendritiques et DC+LPS+Vit D3, extrêmement stimulant pour la production d’IL-10.

SLIT à l’OVA chez la souris avec ces adjuvants : on a eu une efficacité augmentée.

Est-ce qu’on change IL-10 et IFN gamma ? On ne le pense pas.

Ce qui est ressorti de cette étude, c’est l’importance du contact allergène-muqueuse.

Conclusion :

• L’induction de cellules T régulatrices est l’hypothèse de travail pour une immunothérapie efficace.
• Les implications pour le développement de vaccins :
  • Allergènes recombinants à configuration « naturelle ».
  • Association avec des adjuvants induisant la production d’IL-10 et TGF béta.

Tout ceci devrait conduire à des améliorations en terme d’efficacité, de tolérance et de facilité d’administration.

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Biodistribution des allergènes dans les immunothérapies locales chez l’homme.

Marcello Bagnasco, Italie.

Maintenant que la voie sublinguale est largement répandue, on va essayer de comprendre...

Plusieurs voies possibles pour une immunothérapie : orale, sublinguale, intranasale.

Plusieurs points restent à éclaircir en regard de l’efficacité clinique maintenant bien documentée :

• Les données cinétiques : absorption et devenir de l’allergène.
• Mécanisme d’action

Suivi scintigraphique d’allergènes marqués.

Principe :

• Suivi radio de deux allergènes marqués à l’iode 123 par scintigraphie.
• Deux allergènes ont été étudiés :
  • Par j 1 : l’allergène principal du pollen de Parietaria judaïca, une glycoprotéine de 12.5 kD.
  • Der p 2 : un des deux principaux allergènes de Dermatophagoides pteronyssimus, une glycoprotéine de 14 kD.
• Les résultats de l’étude (chez sujets sains) ont été publiés en 1997.
• On a étudié en plus l’effet de modifications chimiques sur la cinétique par l’utilisation d’un allergoïd monomèrique (Monoïd)
• Cet allergoïd a été obtenu par carbamylation sélective de l’epsilon-aminogroupe des résidus de lysine.
• Ces modifications ont entraîné :
  • Une allergénicité réduite et une immunogénicité conservée.
  • Une dimension inchangée de la molécule (monomère).
  • Une biodisponibilité conservée.

Résultats :

• Pas de passage sanguin avant d’avaler (la radioactivité est inchangée jusqu’à l’avalement).
  (suite à l’exposé de Philippe Moingeon, on peut peut-être noter l’absence de caméra focalisée sur les structures ganglionnaires)

Conclusions :

• Dans les conditions expérimentales présentes, l’allergène n’est pas absorbé au niveau sublingual.
• Il persiste jusqu’à 36 heures dans la région sublinguale.
• L’iode 123 est détectable dans la région sublinguale pendant 12 heures après administration.
• Pas de dégradation de l’allergène marqué au niveau sublingual jusqu’à 30 minutes après administration.
• La radioactivité plasmatique n’apparaît qu’après avalement.

Si on recrache après 2 minutes (expérience menée chez 3 sujets non allergiques) environ 70% de la radioactivité est de toute façon retenue au niveau sublingual ou avalée, même après que le sujet ait recraché.
Jusqu’à 30% de la radioactivité est retrouvée dans la salive recrachée.

Quand une préparation commerciale est utilisée chez des sujets allergiques, une partie de l’allergène est retenue dans la bouche après avalement.

Les cinétiques de l’allergène natif et de l’allergoïd diffèrent partiellement.

Des traces de l’allergoïd peuvent être détectées dans le plasma après avalement.

Les mêmes observations ont été faites avec les 2 allergènes (Par j 1 et Der p 2).

Voie nasale : étude de la pharmacocinétique chez des sujets sains.

• Après administration, l’allergène est lentement transportée vers le pharynx et l’œsophage.
• L’absorption est parallèle à l’avalement, aucune absorption directe n’a été détectable par cette méthode.
• Une fraction de l’allergène marqué persiste dans le nez pendant des heures.

Chez les allergiques, le transit vers le pharynx haut était plus rapide.

Aucune persistance particulière dans le nez n’a été observée chez l’allergique par rapport aux sujets sains.

Conclusion générale :

• Les études de pharmacocinétique avec des allergènes marqués ont été un outil unique dans l’étude de la biodistribution chez l’homme.
• Il n’y a pas d’absorption rapide transmuqueuse ; la plus grande partie de l’allergène est avalée, quelle que soit le protocole d’administration.
• Une persistance à long terme au niveau muqueux est possible.
• L’inflammation allergique peut affecter l’absorption et/ou la persistance au niveau nasal.
• Une modification chimique peut perturber la bio distribution et le devenir de l’allergène.

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Préparations recombinantes de pollens de bouleau et de Poacées en clinique.

Annemie Narkus, Allemagne.

Avantages des allergènes recombinants en immunothérapie spécifique :

• Seulement des protéines pertinentes.
• Optimisation du dosage de tous les composants.
• Protéines pures de qualité pharmacologique consistante.
• Ils sont une base pour le développement de variants des allergènes.
• Ce sont des outils permettant d’avoir une vue plus en profondeur des mécanismes de l’allergie et de l’immunothérapie spécifique.

Étude portant sur une immunothérapie avec des allergènes recombinants de Phleum.

• Utilisation d’un cocktail de 5 allergènes majeurs en concentrations équimolaires (Phl p 1 : 10 µg, Phl p 2 : 5 µg, Phl p 5a : 10 µg, Phl p 5b : 10 µg, Phl p 6 : 5 µg).
• Etude contrôlée en double aveugle contre placebo, menée de Janvier 2002 à Aout 2003.
• Résultats :
  • Efficacité constatée en terme de score symptômes, score médicamenteux, augmentation des jours sans symptômes, amélioration de la qualité de vie.
  • Les résultats ont été nettement améliorés la deuxième année.
• Biologiquement :
  • Diminution des IgE.
  • Augmentation des IgG 1 et surtout des IgG 4.
  • En sortie d’étude, 4 patients ont été négatifs pour les IgE.

Tolérance :

• Le placebo contenait de l’histamine afin de ne pas être identifié.
• L’immunothérapie a généralement été bien tolérée ; on a noté des effets adverses habituellement rencontrés en immunothérapie.
• 71 réactions locales, avec ou sans prurit, 6 réactions systémiques (3 urticaires, 1 rhinite, 1rhinoconjonctivite, 1 asthme, 2 jours après l’injection).
• Pour le groupe placebo : 42 réactions locales et 2 réactions systémiques (1 urticaire et 1 rhinite).

La phase II a été publiée dans le JACI, la phase III est en cours.

Etude portant sur rBet v 1 :

• Le variant rBet v 1 = Bet v 1-FV a une activité IgE diminuée mais une activité conservée vis-à-vis des cellules T.
  Les résultats ont été comparés à un extrait naturel.

Dans ce premier essai clinique avec un vaccin hypoallergénique contenant rBet v 1-FV, la comparaison a donc été menée avec un extrait naturel de pollen.

L’efficacité clinique a été prouvée après une courte période de traitement présaisonnier.

La tolérance a été quantitativement et qualitativement comparable à l’extrait naturel.

Question de la salle :

Comment expliquer les réactions systémiques puisqu’on utilise un extrait normalement hypoallergénique ?

• Par les très fortes doses utilisées, peut-être potentialisées par une saison pollinique 2003 très marquée.
• Un variant hypoallergénique pourrait être meilleur que le recombinant étudié : attendons les résultats de la phase III (en cours).

Quand tout cela sera-t-il disponible ? On ne sait pas.