Strasbourg : septembre 2007

Plutôt que de reprendre exhaustivement l’ensemble des présentations, j’ai préféré favoriser une compréhension globale en présentant les bases biochimiques nécessaires. Il a fallu faire des choix devant la qualité de nombreuses présentations et certains points plus précis, de détails, de perspectives ne seront pas approfondis malgré leur intérêt. Les intervenants concernés et les titres de leur intervention sont listés en fin de texte

Rappel d’immunité

Un allergène est une molécule capable de provoquer une réponse immunitaire allergique chez l’homme. La majorité des allergènes sont des protéines.

Cette reconnaissance allergène-anticorps provient de forces d’attraction intermoléculaires dues à une complémentarité structurale souvent comparée à l’interaction d’une clé et d’une serrure.

Pour mieux comprendre les mécanismes des réactions allergiques, comprendre les réactions croisées, améliorer le diagnostic et proposer des immunothérapies efficaces, il importe de mieux comprendre la structure des protéines.

Rappel de quelques notions sur les protéines

Les protéines sont des composants importants de tous les organismes vivants. Elles interviennent à de nombreux niveaux. Il pourra s’agir d’un rôle de catalyseurs, de régulation (hormones), de protection (immunoglobulines), de transport, de structure ou liées à la mobilité cellulaire.

Tout protéine est composée d’une succession, d’une séquence linéaire d’acides aminés liés entres eux par des liaisons peptidiques (de type amide). Un acide aminé est une molécule organique possédant une fonction amine (-NH2) et un acide carboxylique (-COOH). Ils diffèrent entre eux par la structure de leur chaîne latérale. On peut différencier les acides aminés hydrophobes (Alanine, Valine, Proline, Leucine, Isoleucine, Méthionine, Cystéine, Glycine, Phénylalanine et Tryptophane) et hydrophiles. Parmi ces derniers, on pourra les classer en neutres (Asparagine, Glutamine, Serine, Thréonine, Tyrosine), basiques (Lysine, Arginine, Histidine) ou acides (Aspartate, Glutamate).

Cette succession d’acides aminés va constituer la structure primaire de la protéine. Les chaînes latérales des différents acides aminés vont pouvoir interagir entre elles, via des liaisons non-covalentes (force de Van der Waals, pont Hydrogène) ou covalentes (pont disulfure) pour stabiliser la structure. On observera donc une structure secondaire (hélice alpha, feuillet plissé ß par exemple), tertiaire et parfois quaternaire (oligomères composés de plusieurs monomères) dus au reploiement de la protéine.

Bien que « l’apparence » de la protéine soit liée à sa structure primaire, elle est difficilement prévisible.

Les parties spécifiquement reconnues de l’allergène sont appelées épitopes (ou déterminants antigéniques). Pour simplifier, on parle des épitopes B, reconnus notamment par les lymphocytes B tandis que les lymphocytes T reconnaîtront l’allergène via leur épitope T. L’épitope peut être linéaire (lié à la séquence d’acides aminés) ou conformationnel (reconnaissance de zones non successives mais proches)

Certaines protéines vont ensuite subir un processus de glycosylation (fixation de sucres). Cette glycosylation va rendre la protéine plus hydrophile, la protéger contre les protéases et augmenter sa stabilité en fixant sa conformation.

L’unité de mesure de poids de macromolécules est le kDa ou kiloDalton. Un Dalton correspond au poids d’un atome d’hydrogène. Le Svedberg, de symbole S, est une unité de mesure du taux de sédimentation. Le taux ou coefficient de sédimentation d’une particule ou macromolécule est calculé en divisant la vitesse à laquelle la particule sédimente (en m/s) par l’accélération appliquée. Un Svedberg vaut exactement 10-13s.

Une source allergénique contient un nombre important de protéines. On peut séparer celles-ci grâce à leurs propriétés physiques (électrique, solubilité différentielle).

Différentes protéines ont pu être séparées, étudiées pour déterminer leur structure primaire.

Une fois cette séquence d’acides aminés déterminée, il va être possible de faire fabriquer cette protéine par des micro-organismes. On parle alors d’allergènes recombinants.

Historique, par Gabrielle Pauli - Strasbourg

Nombreux ont été les scientifiques qui ont participé aux avancées des connaissances en allergologie.

Depuis la description du coryza chronique au XVIIème siècle jusqu’aux avancées techniques prévues pour les prochaines années, la recherche est jalonnée par des étapes importantes : Si l’on considère le cas des acariens, nos connaissances nous ont fait progressé de l’allergie à la « poussière de maison » à la détermination détaillée de l’allergène « der p2 » (pour dermatophagoïdes pteronyssinus 2).

La biologie moléculaire, et la meilleure compréhension des mécanismes, de la structure des allergènes, permettront de mieux comprendre des phénomènes inexpliqués jusqu’à présent comme les réactivités croisées (entres allergènes respiratoires ou alimentaires).

Les vaccins seront également plus performants s’ils sont produits sur des bases standardisées et reproductibles.

Allergènes végétaux, par Christian Radauer - Vienne

Il est possible de trouver des listes officielles d’allergènes, triés par source, sur les sites : http://www.allergen.org/ et http://www.allergome.org/. Bien que les sources soient principalement les pollens et les aliments, il est possible d’affiner la source selon les connaissances que l’on a des protéines.

Les caractéristiques influençant l’allergénicité seront différentes selon qu’il s’agisse d’un pollen ou d’une protéine alimentaire.

Une protéine alimentaire sera d’autant plus allergisante qu’elle est stable à la digestion protéolytique, à l’acidité et à la chaleur.

Pour les protéines polliniques, ce sont leur solubilité et leur capacité d’extraction rapide à partir du grain qui vont déterminer leur caractère allergisant. Les séquences et structures des protéines étant de mieux en mieux connues, il est devenu possible d’identifier des « familles » de protéines selon leurs homologies structurelles.

Les Prolamines constituent une super-famille contenant un grand nombre d’allergènes végétaux.

• Ces protéines sont de faible poids moléculaire et sont constituées de 4 hélices alpha stabilisées par des liaisons disulfures.
• L’albumine 2S se trouve fréquemment dans les graines et fruits à coques (FAC), les ns-LTP (protéines de transport lipidique non spécifiques) se retrouvent non seulement dans les graines mais aussi dans l’épiderme des fruits.
• La présence d’un tunnel hydrophobe central suggèrerait un rôle dans la médiation du transfert des phospholipides entre les vésicules et les membranes.
• Elles sont distribuées largement dans les fruits, noix, graines, légumes, pollens et même dans le latex.
• Les Inhibiteurs de trypsine et d’alpha-amylase interviennent dans la digestion des amidons et protéines dans les graines de blé, d’orge, de seigle, de maïs et de riz.

Les Profilines sont des protéines de structure présentes dans le cytosol de toutes cellules eucaryotes.

• Ce sont des protéines globulaires (12-15 kDa) centrées sur des feuillets plissés ß anti-parallèles entourés d’hélices alpha.
• Les profilines se lient à d’autres protéines pour réguler la polymérisation de l’actine.
• Ce sont des protéines fort bien conservées, c’est-à-dire que même dans des organismes éloignés on peut retrouver une homologie de séquence importante.
• Elles sont souvent impliquées dans des réactions croisées.

Les Homologues de Bet v1 (allergène du bouleau), appelées également PR10-like (ressemblant à la famille protéique « pathogenesis-related » 10)

• sont composées de 7 feuillets anti-parallèles entourés par une longue hélice alpha (côté C-terminal) et par deux petites hélices (côté N-terminal).
• Ce sont des protéines de « défense ».
• Ces protéines pourraient avoir un rôle dans le transport des stéroïdes végétaux.
• On les trouve dans les pollens, certains fruits et graines en assez forte concentration. Ce qui explique certaines réactions chez des personnes allergiques au pollen de bouleau.

Les Globulines interviennent dans le stockage des graisses.

• Elles possèdent une structure centrée sur un tonnelet alpha.
• On les trouve en très grand nombre dans les graines et les noix.
• Celles de petites tailles (7/8S) sont des vicilines, tandis que les plus grosses (11/12S) sont les plus fréquentes dans les légumes, les légumines.

Les Expansines et expansine-like sont des glycoprotéines catalysant le relâchement de la membrane durant la croissance cellulaire.

• Elles agiraient en brisant les liaisons non-covalentes entre les polysaccharides.
• Elles possèdent, du côté N-terminal, 6 tonnelets alpha stabilisés par 3 ponts disulfures tandis que le côté C-terminal est sous forme de sandwich alpha.
• Ce sont souvent des allergènes mineurs qui ne seraient présents que dans les graminées.

La Polcalcine est une protéine cytosolique de 9 kDa.

• Elle possède deux sites de fixation d’ions Ca2+ sur une structure « EF hand ».
• Sa fonction n’est pas connue.
• Il s’agirait d’un allergène mineur.

Les protéines animales, par Christiane Hilger - Luxembourg

La Tropomyosine régule les contractions musculaires.

• C’est une protéine fort conservée, composée d’une hélice alpha, de poids moléculaire 35-38 kDa.
• On la retrouve dans les crustacées, mollusques, dans l’anisakis simplex (ver parasite de poissons) ainsi que parmi les allergènes d’acariens et de blattes.

La Lipocaline transporte de petites molécules hydrophobes (lipides, hormones).

• Les lipocalines d’origines différentes présentent un faible degré d’homologie.
• La lacto-globuline fait partie de cette famille.
• On retrouve également des allergènes présents dans les squames de mammifères, des allergènes d’acariens, de blattes, de tique du pigeon,…

Les PR-1 (pathogenesis related protéins) présentent de grandes analogies de séquences entres-elles. On les retrouve notamment dans les venins.

Trypsin-like serine protease Protéines liant les ions calcium via un domaine « EF hand ».

• Ces protéines lient des ions Ca2+.
• Le site de liaison au calcium est une zone fort conservée au sein de la famille.

Les albumines sériques sont des protéines plasmatiques.

• Elles peuvent fixer le l’eau, des cations, des acides gras, des hormones, etc.
• Elles vont pouvoir réguler la pression osmotique du sang.
• On en retrouve dans les squames aussi.
• Ce sont des protéines souvent impliquées dans les sensibilisations croisées entre espèces.

Les Globines sont impliquées dans le transport de l’oxygène au sein d’un hème.

Les sensibilisations croisées, par Ronald van Ree - Amsterdam

La sensibilisation croisée va provenir d’une reconnaissance par un anticorps d’une protéine dont la morphologie est proche.

Outre les nombreuses allergies croisées déjà décrites, on a pu observer des réactions liées à la consommation d’escargots chez des personnes traitées par immunothérapie spécifique pour une allergie aux acariens.

Parmi les IgE spécifiques, on en trouve certains reconnaissant spécifiquement la partie carbohydrate de la protéine. Ce sont des anticorps qui ont un spectre de reconnaissance large.

Même si in-vitro il peut y avoir libération de médiateurs suite à une stimulation de ces IgE, il s’agit souvent de sensibilisation ne donnant pas lieu à des symptômes cliniques.

L’effet d’un traitement des protéines, par Marie Montserrat Fernandez-Rivas - Madrid

Pour être reconnue par un anticorps spécifique, la protéine doit avoir une morphologie particulière.

On constatera une modification de l’allergénicité avec la chaleur, variable selon le type de protéines.

Les protéines thermolabiles vont se déployer et perdre leur allergénicité, certaines protéines thermostables (parfois stabilité limitée selon les conditions) vont se révéler résistantes.

Certaines protéines subiront une réaction de Maillard, c’est-à-dire un brunissement non enzymatique. Cette réaction peut modifier la morphologie en créant de nouvelles zones reconnaissables par des anticorps.

Les allergies professionnelles, par Monika Raulf-Heimsoth - Bochum

Les allergies professionnelles sont souvent causé par des allergènes de nature non protéique (appelés haptènes), pourtant le mécanisme serait similaire.

Cet haptène se fixerait en effet sur des protéines déjà présentes dans l’organisme engendrant une modification de morphologie.

Encore plus que dans d’autres domaines, il est important de posséder un extrait allergénique de qualité.

L’utilisation d’allergènes recombinants permettrait d’augmenter la reproductibilité et d’obtenir des protéines isomorphes.

Des études sont actuellement en cours pour la farine et le latex.

Conception de molécules hypoallergéniques, par Marianne Van Hage - Stockholm

La fixation d’IgE couplés à des antigènes sur des récepteurs en surface de cellules effectrices (mastocytes et basophiles) va provoquer la libération de médiateurs (dont l’histamine) qui vont causer une réaction d’inflammation et mener aux symptômes d’allergie.

Traditionnellement, seuls les symptômes sont soulagés. Par exemple, les antihistaminiques vont agir en empêchant la libération de médiateurs.

Le cours de la maladie allergique va uniquement pouvoir être modifié par l’immunothérapie.

L’immunothérapie spécifique (aussi couramment appelée désensibilisation) consiste à induire une tolérance en donnant régulièrement une quantité croissante de l’allergène en cause.

Les premières immunothérapies se faisaient par voie injectable. L’injection de l’allergène (souvent additionné d’adjuvant comme l’hydroxyde d’aluminium) va stimuler la production d’IgG.

L’extrait allergénique utilisé provient directement de la source. Il contient de nombreux composés variables d’un lot à l’autre. Il peut même y avoir contamination par d’autres allergènes ou par des endotoxines.

Cette composition mal définie provoque d’ailleurs des effets secondaires et même parfois de nouvelles sensibilisations.

De nouveaux procédés, utilisant les biotechnologies et les connaissances acquises récemment sont en cours de développement.

L’objectif sera donc de produire des protéines recombinantes ressemblant aux allergènes naturels en terme de propriétés physico-chimiques et immunologiques.

Il sera ensuite possible de tenter de les modifier pour que, par exemple, ces protéines puissent se fixer aux IgE en les déformant pour qu’elles ne soient plus capables de se lier aux cellules effectrices.

Point de vue clinique et perspectives, par Gabriele Pauli - Strasbourg

Les extraits allergéniques actuels sont non standardisés et contiennent d’autres protéines.

Pour un vaccin, il est nécessaire de posséder un produit dont la pureté s’apparente à celle des produits pharmaceutiques (Good Medical Practice selon International Conference of Harmonisation).

Des recherches sont en cours pour produire des dérivés à activité allergénique réduite. Ces allergènes recombinants devront avoir des épitopes B et T similaires aux molécules naturelles.

Des essais ont lieu dans différentes pistes concernant : les allergènes recombinants, les dérivés hypoallergéniques, des hybrides, des modifications d’épitope T ou B, des effets de conjugaison (avec certaines protéines bactériennes par exemple),…

Autres intervenants : Anne Casset - Strasbourg (Identification et clonage de nouveaux allergènes) ; Pascal Poncet – Paris (Qu’est-ce qu’Allergome ?) ; Laurence Guilloux – Lyon (détection IgE) ; Jörg Kleine-Tebbe – Berlin (valeur prédictive des IgE spécifiques) ; Jonas Lidholm - Uppsala ( diagnostic in-vitro et allergènes recombinants) ; Ulrike Schulmeister – Vienne (test diagnostic par microarray) ; Mayte Villalba – Madrid (Epidémiologie des sensibilisations aux végétaux en Espagne à l’aide des allergènes recombinants) ; Suzanne Vrtala - Vienne (diagnostic et traitement à base d’allergènes recombinants d’acariens) ; Ines Swoboda – Vienne (Parvalbumine, allergène majeur de poisson) ; Nicole Wopfner – Salzbourg (allergènes recombinants d’herbacées) ; Ricardo Asero – Milan (allergies alimentaires croisées) ; Ronald van Ree – Amsterdam (Profilines et CCD) ; Adriano Mari – Rome (LTP et réactions alimentaires sévères) ; Frédéric de Blay – Strasbourg (Application des allergènes recombinants pour la détermination d’allergènes environnementaux) ; Gabriel Peltre – Paris (allergènes non hydro-solubles) ; Jacqueline Dayan-Kenigsberg – Saint Denis (position de l’Affsaps) ; Stefan Vieths –Langen (Modérateur table ronde)