Techniques physico-chimiques de caractérisation des allergènes

Fatima FERREIRA – Vienne.

Plusieurs paramètres pouvant être appréciés par plusieurs méthodes :

De nombreux paramètres interviennent dans la caractérisation des allergènes :

• Identité de séquences
• Pureté
• Homogénéité
• Structure

Pour les méthodes et techniques :

• Analyse des acides aminés.
• Spectrométrie de masse (QTOF.FT)
• SEC-HPLC, SEC-UV-TVA
• Dichroïsme circulaire
• Peptide mapping
• SAXS
• Dynamic Light Scattering (DLS)

Aucune méthode ne pouvant suffire à elle seule pour établir ou comparer chaque aspect structurel ou fonctionnel d’une protéine donnée, il faut un ensemble de méthodes.

– Reprenons point par point les différents paramètres avec, en parallèle, leurs techniques d’évaluation :

– Pour évaluer l’identité et la pureté des molécules :

• Analyse d’AA
• Spectrométrie de masse (« naked » ESI-QTOF mass spectometer)

Peptide mapping et analyses de spectrométrie de masse : on obtient une empreinte de peptides que l’on peut fragmenter pour en tirer des informations quant aux séquences en cause.

Des appareils plus sophistiqués peuvent être utilisés comme le « Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectometry – FTICR MS »

L’avantage est une résolution extrêmement élevée par rapport aux techniques classiques.

– Pour évaluer l’homogénéité des préparations allergéniques :
– HPLC- SEC-UV-TDA
– Small-angle-X-ray scattering (SAXS)

• SAXS : détermination de la taille de la molécule, de sa forme et de son état d’aggrégation. Cette technique se pratique sur des préparations d’allergènes en solution.
• SEC-UV à triple détection : on obtient des courbes différentes selon que l’on a affaire à un monomère, un dimère ou un trimère.

Sont précisés : poids moléculaire, structure moléculaire (densité) concentration à chaque point de donnée et composition des copolymères.

– Pour évaluer la structure : Circular dichroïsme (CD)

Qui peut être utilisée pour apprécier structure secondaire, changements conformationnels, effets environnementaux et folding et dénaturation de la protéine.

Par ex le projet CREATE avec nBet v 1, rBet v 1a, nPhl p 5, rPhl p 5a et rPhl p 5b.
On peut détecter tout changement induit par la méthode de préparation des Ag

Résultats pour la préparation allergénique Bet v 1 :
– nBet v 1 : protéine foldée, mélange d’isoformes dont Bet v 1a est le composant majeur (78%) , tendance à l’aggrégation et à la précipitation.

Méthodes analytiques :
– Spectrométrie de masse : FTICR-MS de protéines intactes ne devrait pas remplacer les techniques de peptides mapping.
– SAXS, SEC-UV-TDA, DLS : le dispositif de triple détection (TDA) et le dynamic light scattering (DLS) sont de très bonnes alternatives au SAXS.

Résultats pour la préparation allergénique Phl p 5 :
– nPhl p 5 : protéine foldée, tendance à l’aggrégat à une haute concentration en sel et en protéine, mélange d’isoformes a et b.
– rPhl p 5a : protéine foldée monomérique, tendance à l’aggrégat à de hautes concentrations de sel et de protéine.
– rPhl p 5b : protéine foldée monomérique, tendance à l’aggrégat à de hautes concentrations de protéine.

Méthodes analytiques :

SAXS, SEC-UV-TDA, DLS : le dispositif de triple détection (TDA) et le dynamic light scattering (DLS) sont de très bonnes alternatives au SAXS.

Au total, si l’on suit le groupe « bioanalytical toolbox for allergen standardisation de l’université de Salzbourg, on peut retenir un « set » de méthodes :

– Identité :

Intact mass spectrometry
nanoLC-MSMS-based peptide mapping

– Quantité :

Amino acid analysis (PicoTag method)
Micro-Kjedahl (nitrogen content)

– Homogénéité :

Online HPSEC-UV-triple detection array (SEC-TD)

– Folding :

Circular dichroïsm (CD)

– Aggrégation en solution :

Dynamic light scattering (DLS)

---

Mesure des IgE spécifiques vis à vis des allergènes individuels et des peptides allergéniques en matière de diagnostic d’allergie alimentaire.

Kirsten Beyer – Berlin.

L’allergie alimentaire est une affection féquente dont les symptomes sont variés, intéressant aussi bien la peau que l’appareil respiratoire et le diagnostic toujours difficile.

– Nous manquons encore de tests in vitro performants :

• Pour le diagnostic de réactivité clinique
• Pour prévoir l’évolution naturelle de la maladie.
• Pour déterminer les réactivités croisées cliniques.

La majorité des réactions allergiques à des aliments sont IgE médiées.

De plus, les IgE spécifiques sont souvent présentes en dehors de tout symptome.

Et par ailleurs, certains patients réagissent alors que leurs IgE ne sont pas détectables (mais dans ce cas, il est vrai que nous n’avons pas la preuve d’un mécanisme IgE-médié)

– Le taux d’IgE est-il prédictif d’une réactivité clinique ?

Le problème semble dépendre de la nature de l’allergène.

– Extrait natif versus allergènes individuels : nous devons choisir les bons « allergènes ».

• Par exemple dans l’allergie au blé, si l’on veut reconnaitre ceux qui sont cliniquement réactifs : Les IgE spécifiques du blé ne discriminent pas les tolérants des allergiques alors que les IgE spécifiques de l’Omega-5 gliadine sont nettement positifs chez les allergiques.
• Extrait natif ou Ber e 1 (Noix du Brésil) : Quelques patients ne reconnaissent que Ber e 2... Donc la mesure d’IgE spécifique peut être utile, incontestablement, en allergie alimentaire.

– En matière de prédiction de la marche naturelle de l’allergie : Futurs tolérants ou allergie persistante ?

L’IgE réactivité vis à vis de peptides représentant les épitopes connus d’un produit allergisant peut nous apporter une réponse , aucun patient tolérant ne présentant d’IgE se liant à ces peptides.

– Réactivités croisées : si allergie arachide : 5% de risque de réagir à un autre aliments issu d’une plante appartenant à la même famille des Fabacées.
Alors qu’il y a 23 à 50% de risque de réaction à un fruit à coque.

Dans ce cas, quels conseils d’éviction donner ?

La mesure d’IgE anti peptides représentant les sites de liaison avec les IgE peut être utile en matière d’allergie aimentaire (montrant par ex une IgE réactivité vis à vis de partie peptidiques de protéines de réserve de graines constituant une partie commune à plusieurs épitopes, expliquant de ce fait la réactivité croisée...)

– Enfin, les chips (microtechnologie) vont bienôt être disponibles, permettant d’établir un profil d’IgE réactivité à une centaine d’allergènes, mais il reste un manque en matière de test in vitro dans le diagnostic d’allergie alimentaire.

– En conclusion :

• Nous ne disposons toujours pas du test optimal.
• Des protéines individuelles sont préférables à des mélanges d’extraits allergéniques.
• Des tests d’IgE spécifiques de peptides semblent être une aide dans la prédiction de l’évolution naturelle de la maladie et de la détermination des réactivités croisées.

Anaphylaxie.

Antonella Muraro – Padoue.

– Il y a un manque de définition universelle, ainsi qu’un manque de biomarqueurs, sans parler d’un manque de codification du traitement.

– L’anaphylaxie clinique :

• C’est une réaction aigue médiée par les IgE.
• Définition clinique versus immunologique.
• La plupart des patients présentent des symptômes oraux et/ou généraux, mais les réactions sévères sont d’abord dues aux voies respiratoires basses ou à l’appareil cardiovasculaire.
• L’évolution est dépendante de la source de l’allergène et diffère selon les sujets.
• De nombreuses réactions se résolvent spontanément.
• Il n’y a pas de preuves appuyant le concept de réactions de sévérité croissante au fur et à mesure des contacts.
• La sévérité de la réaction détermine l’intervention thérapeutique et les recommandations à suivre pour d’éventuelles futures réactions.
• La survenue des symptomes majeurs : 30’ pour des aliments, 15’ pour des insectes et 5’ pour les réactions iatrogéniques.

– L’évolution est parfois fatale :

• Dans 23% des cas pour les aliments.
• Dans 15% des cas pour les insectes.
• Dans 42% des cas pour les médicaments

– Cette évolution fatale reonnait plusieurs modes selon les étiologies :

• Pour les aliments : asthme, asthme/larynx, larynx, choc.
• insectes : asthme, asthme/larynx, larynx, choc.
• médicaments : asthme, asthme/larynx, larynx, choc.

– Epidémiologie :

La prévalence des réactions d’allergie immédiate est peu documentée, principalement pour 3 raisons :
Un manque de définition, la rareté des troubles qui sont de plus de survenue rapide et la sous utilisation des codes internationaux des maladies.

La pyramide des données se construit en partant des données concernant la population générale, jusqu’aux données sur les modalités de décès par anaphylaxie.

Le taux d’incidents (pour 100000 personnes et par an) selon les pays :

• Danemark : 3.2 en 1989
• Suisse : 7.9-9.6 en 2004
• Royaume-uni : 8.4 en 2004
• Allemagne :9.8 en 1995
• Australie : 9.9 en 2000
• USA : 21 en 1999
• France : 70 « réactions générales immédiates » pour 10000 personnes en 2001 (étude de G.Kany)

– Une réaction allergique généralisée rapide dans sa survenue et qui peut progresser jusqu’à la mort.

Cette définition vient du 2é NIH-FAAN consensus meeting.

3 critères permettent d’identifier dans plus de 95% des cas ce type de réaction :

• Survenue rapide (en minutes ou en heures)
• 2 atteintes au moins après exposition à un allergène pertinent pour le patient parmi :
  Peau/muqueuses, voies respiratoires, tension artérielle réduite ou symptomes associés, symptomes généralisés persistants.
• Tension artérielle réduite après exposition à un allergène connu pour ce patient. (en minutes ou en heures).
  • Enfants : baisse de la systolique, selon l’âge ou baisse de la systolique de plus de 30%.
  • Adultes : Systolique inférieure à 90 ou chute supérieure à 30%.

Un position paper de l’EAACI va bientôt être disponible au sujet de la prise en charge de l’anaphylaxie chez l’enfant..

– Le traitement résulte d’une coopération entre l’urgentiste, les associations de patients, le pédiatre et l’allergologue.

– Adrénaline

• Identification des sujets à risque
• Plan d’action sur mesure à communiquer aux structures concernées (famille, école, professionnels de la santé impliqués).

Les modalités d’utilisation de l’adrénaline auto-injectable rappelées par Antonella Muraro étaient classiques, nous ne les rappellerons pas ici.

– Trois points concernant le traitement « hors-adrénaline » :

• Béta agonistes inhalés : oui avec chambre d’inhalation pour les sibilants modérés.
• Les antiH1 ne sont qu’un traitement de deuxième ligne, certainement utiles pour les troubles cutanés, probablement pas utiles en ce qui concerne la tension artérielle.
• Stéroides : Leur rôle dans l’anaphylaxie n’a pas été prouvé : contrôle d’une réaction biphasique ?

Au total des instructions individuelles claires sont impératives ainsi qu’un entrainement du sujet et/ou de sa famille avec une vérification régulière par le praticien.

– Conclusion :

• Nécessité de développer de nouveaux outils et modèles dans la perspective d’une mise en réseau des différents acteurs et services concernés.
• Nécessité de données de prévalence et d’incidence basés sur la nouvelle définition de la réunion de consensus.
• Nécessité de centres d’excellence...

Expérience italienne de la Vénétie.(Veneto Region Register for Anaphylaxis)

Avec une base de donnée interactive et un site web, pour l’autoéducation et la répercussion des guidelines.

---

Les pommes ont la pêche mais peuvent conduire les patients polliniques au bouleau dans les noix ! réactivité croisée immunologique comme base d’allergie alimentaire.

Barbara Bohle – Vienne.

Une pomme par jour gardera le médecin éloigné ! Mais l’allergie à la pomme, ça existe aussi...

Cette allergie, responsable d’un syndrome d’allergie orale aux fruits crus, associée à la pollinose au pollen de bouleau, a été étudiée du point de vue des soubassements immunologiques (Mal d 1 et Bet v 1) et sous l’angle des effets de l’immunothérapie au pollen de bouleau sur la réponse allergique à Mal d 1.

Si on incube des sera de patients polliniques allergiques à la pomme avec Mal d 1 ou Bet v 1, c’est avec Bet v 1 que l’on a l’inhibition la plus nette.

Plusieurs profils de CR évalués par des cones de cellules T spécifiques de Mal d 1.
Bet v 1 domine la réponse allergique à Mal d 1.

Mais il existe des réponses à Mal d 1 avec une absence de réponse à Bet v 1.

– L’ITS au pollen de bouleau guérit-elle aussi l’allergie à la pomme ?

20 patients allergiques au pollen de bouleau avec OAS à la pomme.
Etude avant et après 1 an de SLIT

Certains ont négativé leurs TPO
Pour les réponses en anticorps spécifiques de Bet v 1 et de Mal d 1 ainsi que les réponses de prolifération cellulaire allergènes-spécifiques, on observe une action à ces 2 niveaux

Diminution des cellules T Bet v 1 spécif
Augmentation des IgG4 et des IgE anti Bet v 1.

Mais la SLIT n’a jamais changé les IgE spécifiques de Mal d 1 ni les IgG4, pas plus que les réponses en cellules T.

Cliniquement, la SLIT n’a pas amélioré le syndrome oral à la pomme.

– La SLIT peut induire des changements immunologiques restreints à l’allergène utilisé dans la désensibilisation.

La CR entre Bet v 1 et Mal d 1 est suffisante pour induire une allergie alimentaire mais pas pour la soigner.

Si l’on veut soigner une allergie alimentaire associée à une pollinose, il faudrait utiliser des vaccins contenant des pollens et des aliments.