2nd symposium international sur l’allergologie moléculaire – Rome 22 au 24 avril 2007. Congrès du Dr Hervé Couteaux - 2ème jour

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2nd symposium international sur l’allergologie moléculaire – Rome 22 au 24 avril 2007. Congrès du Dr Hervé Couteaux - 2ème jour

2nd symposium international sur l’allergologie moléculaire – Rome 22 au 24 avril 2007. Congrès du Dr Hervé Couteaux - 2ème jour

mardi 24 avril 2007, par Dr Hervé Couteaux

Cette deuxième journée romaine a été l’occasion de faire connaissance avec des médiateurs lipidiques relargués par les pollens qui ne restent pas les mains dans les poches, de souligner, par la voie de Ronald Van Ree, les défauts de nos extraits allergéniques, tout simplement dépourvus de trop nombreux allergènes ce qui n’a pas manqué de provoquer quelques crises d’urticaire dans la salle, ce dont a profité Ricardo Asero pour nous livrer quelques nouveautés dans la physiopathologie des urticaires chroniques sévères.
Quelques notions de bioinformatiques nous ont été fort utiles pour comprendre tout l’intérêt que pouvait avoir la base de données AllFam, présentée par Christian Radauer. Enfin, une présentation d’analyse biologique multiple.
Au total, une journée riche et variée, du fondamental à la clinique, sous l’oeil impitoyable de la logique moléculaire qui en définitive et si elle ne résout pas encore tout, clarifie bien des problèmes...

Les pollens font leur chemin ; micromilieu TH2 généré par des médiateurs lipidiques associés aux pollens (PALMs)

Claudia Traidi-Hoffmann - Munich

Des anthères au stigma, les grains de pollens assurent une mission de reproduction qui se terminera peu après la germination quand les conditions rencontrées sont optimales (après des échanges d’eau, de sucre, de lipides et de protéines)

Les grains de pollens sont plus que des simples transporteurs d’allergènes.
- Ils relarguent des médiateurs lipidiques (Behrendt, 2000)
- Ils sont immunomodulateurs :

  • PALMLTB4, un des médiateurs lipidique associé au pollen, active les neutrophiles humains et les éosinophiles in vitro.
  • PALMPGE2, un autre médiateur lipidique associé au pollen module les fonctions des cellules dendritiques, conduisant à un renforcement de l’induction Th2 pour les cellules T naïves.

Le pollen contient une substance favorisant une réponse Th2 des cellules dendritiques.

Quand on fait un patch test au nickel versus patch au pollen, et que l’on note les conséquences pour IFN-gamma et IL-5, on s’aperçoit que le pollen contient des substances induisant une réponse TH2 au niveau des cellules dendritiques humaines.

Les phytoprostanes associées au pollen inhibent la production d’IL-12 et augmentent la polarisation cellulaire vers la voie Th2.

Quand on costimule les cellules dendritiques (DC) avec un extrait aqueux de pollen (APE) de bouleau on a une induction de CXCR4 et une réduction de CCR1/5.

Si l’on étudie les effets d’extraits de pollen aqueux sur les cellules dendritiques en terme de production de récepteurs des chémokines, on a une réduction de l’expression de CCR1/5 et induction de CXCR4 sur les cellules dendritiques.

Il y a une augmentation de la réponse à une stimulation par LPS des cellules dendritiques (CD) au CXCL12, ligand de CXCR4 et ce mécanisme est dépendant de l’AMP cyclique.

Quel est le responsable de ces effets ?

Ce sont des substances dérivées de l’acide linoléique, les PALMs.

PPE1 bloque l’expression des CCL5, CXCL10 et CCL22 induits par la stimulation par LPS et conduit à une réduction Th1 couplée à une stimulation Th2 pour les CD.

In vivo, l’exposition à APE de bouleau induit un shift Th2 au niveau des ganglions lymphatiques satellites.

Les lipides de pollens agissent comme des adjuvants et également comme des allergènes, avec reconnaissance cellulaire.

PALMs dévient les cellules dendritiques vers la voie TH2, induisent un milieu TH2, déséquilibrant la balance TH1-TH2 du côté TH2.

Pourquoi ne sommes nous pas tous allergiques ?

On étudie les récepteurs des PALMs pour étudier ce qui différencie les allergiques des non allergiques, mais on n’a pas encore vraiment la réponse...

Par ailleurs, il semblerait qu’il y ait beaucoup moins de PALMs dans les pollens réputés moins allergisants.


Les allergènes de la noisette pour un diagnostic moléculaire

Ronald Van Ree – Amsterdam

Les allergènes de la noisette sont nombreux :
- Un rapide regard sur le site allergome nous renseigne sur le nombre effectivement élevé d’allergènes issus du noisetier.
- Certains sont bien documentés (Cor a 1, un Bet v 1 homologue, Cor a 2, une profiline, Cor a 8, une LTP)
- D’autres n’ont suscité qu’un ou deux « articles » (Cor a 9, une 11S, Ara h 3-like,Cor a 10, une luminal binding protein, HSP-like,Cor a 11, une 7S, Ara h 1-like)
- D’autres enfin sont « cachés » comme Cor a thaumatin-like protein (TLP).

Pourquoi le diagnostic devrait-il être moléculaire ?
- pour 2 raisons essentielles :

  • La qualité des extraits, souvent faible dans notre pratique.
  • Et le fait que les allergènes moléculaires nous racontent souvent une histoire différente.

Pour comprendre pourquoi certains allergènes manquent dans les extraits, il faut un rappel des procédures d’extraction :
- Fragmentation des tissus dans un tampon aqueux et extraction sont les 2 premières étapes.

  • Phadia a réalisé que son extrait de noisette ne faisait pas réagir tous ceux qui auraient du : ils l’ont donc récemment enrichi de l’allergène manquant, en l’occurrence Cor a 1.

- Après ces 2 premières phases, Séparation solide/soluble par centrifugation, filtration et extraction des graisses.

Pour la fraction « oil body » on a un doublet d’oléosine, manquant actuellement dans les extraits dont nous disposons.
- Ces oléosines sont des constituants protéiques majeurs des noix et des graines
- Or environ 50% des patients reconnaissent les oléosines...

D’autres exemples d’allergènes manquants dans des extraits allergéniques :
- LTP (Cor a 8)
- TLP (Thaumatin-like protein)
- Cor a 9 : Kirsten Beyer y travaille
- Cor a 11, 38kD
- Mais ce sont des allergènes difficiles à manipuler, avec notamment des problèmes de solubilité, ce qui explique peut être le faible nombre d’études. On peut juste dire qu’il existe une certaine réactivité vis à vis de ces allergènes.

Le cas des LTP (Pru p 3, Mal d 3, Cor a 8) :
- Les LTP, c’est un problème méditerranéen !...et pourtant :

  • Etude de Flinterman concernant 26 enfants allemands.
  • 9 enfants avaient des IgE vis à vis des LTP et leur réactivité n’était pas seulement biologique puisque :
  • DBPCFC : 8 enfants ont présenté des signes cliniques et 14 étaient négatifs.
  • Conclusion :
    • la sensibilisation aux LTP n’est pas limitée au bassin méditerranéen
    • le fait d’avoir des IgE élevées contre les LTP est un facteur de risque de réponse positive au TPO.

nCor a 8 : SDS-PAGE versus immunoblot : on obtient 2-3 bandes différentes : pas d’explication

La sensibilisation à Cor a 1 est-elle toujours liée aux pollens des Bétulacées ? Ou plus simplement, la sensibilisation indépendante du pollen existe-t-elle ?
- Sur 25 enfants, 4 réagissaient à Cor a 1 et étaient négatifs à Bet v 1
- La sensibilisation à Cor a 1 peut précéder la sensibilisation à Bet v 1 et peut se voir sans réactivité vis à vis de Bet v 1 : en allergologie moléculaire, il convient donc se méfier des choses considérées comme « acquises »...

Conclusion :
- Le diagnostic moléculaire (traduction de component resolved diagnostic ou CRD) peut aider quand les extraits sont de mauvaise qualité.
- Le diagnostic moléculaire peut apporter des informations cliniques supplémentaires.
- Le diagnostic moléculaire peut nous apporter des informations sur l’origine de la sensibilisation.


Urticaire

Ricardo Asero – Paderno Dugnano, Italie

Nouveautés en étiologie et pathogénie.

Dans les réactions allergiques classiques, l’urticaire (U) est le résultat de la libération d’histamine suite à l’ingestion, l’injection ou le contact avec une molécule protéique (l’allergène) qui ponte les IgE présents à la surface cellulaire.

Mais dans l’U chronique, les mécanismes pathogéniques conduisant à la libération d’histamine sont complètement différents.

L’urticaire chronique, qu’est ce que c’est ?
- C’est un trouble cutané avec éruption continue ou récurrente de papules (parfois avec des angiœdèmes) pendant plus de 6 semaines.
- Sa prévalence est d’au moins 0.1% dans la population générale.
- Les femmes sont d’avantage atteintes que les hommes.
- L’hyperréactivité bronchique est fréquente.
- L’association avec des troubles thyroïdiens auto-immuns peut aller jusqu’à 15%.
- Cas familiaux surtout chez ASST + (96%) (ASST : tests cutanés au sérum autologue)
- Association avec HLA DRB1*04

Immunopathogénie :
- Positive ASST
- Anti-IgE IgG (non fonctionnel)
- Anti-IgE IgG (fonctionnel) histamine release (HR).
- Anti-FceRI IgG : in vitro HR
- C’ activation : c5a (anaphylatoxine) entraînant une augmentation de l’HR in vitro.

On a IgG contre des IgE ou des récepteurs à IgG mais ce n’est pas clair !
- ASST n’est positif que dans 40 à 60% des cas.
- Aucun ASST négatif n’est HRA (Histamine Release Assay) positif, mais seulement 20 à 50% des ASST+ sont HRA+.
- La sensibilité HRA monte jusqu’à 95% en sélectionnant les sera ASST extrêmement positifs et en réalisant de multiples tests avec les basophiles et les mastocytes issus de plusieurs donneurs.
- Des sera avec déplétion en IgG sont négatifs en histamine release mais ASST ne change pas. (Fagiolo, JACI 2000)
- HRA + est causé par une fraction sérique supérieure à 100kD.
- La décomplémentation rend l’HRA négative.
- Chez les patients ASST +++, la réactivité cutanée est pratiquement abolie ou abolie par l’utilisation de plasma hépariné.
- L’héparine inhibe directement et non spécifiquement l’histamine release des mastocytes et des basophiles, à la fois in vivo et in vitro.

Questions ouvertes et problèmes :
- Ab-a-FceRI sont présents dans presque toutes les urticaires chroniques mais induisent une Histamine release chez un faible nombre de patients.
- Ab-a-FceRI sont également détectés dans les urticaires physiques, les maladies auto-immunes et les dermatoses bulleuses, mais, dans ce cas, ils ne provoquent pas d’histamine release (HR).
- Ab-a-FceRI peuvent également être détectés chez des sujets normaux, mais n’induire une HR qu’après stripping des IgE de surface des basophiles et des mastocytes.
- Cependant, ils peuvent interférer avec les tests in vitro.
- Quelques sera induisent HR in vitro en l’absence de Ab-a-FceRI.
- Dans les sera de patients ASST+/HRA-, la présence d’une HRF supérieure à 30kD a été rapportée mais aucune caractérisation supplémentaire n’a été effectuée.
- Il a été rapporté que 10% des sera contenaient une HRF spécifique de mastocytes.

Les urticaires chroniques ASST négatifs : auto-immunité ?
- Similarités des urticaires chroniques ASST+ et - :

  • Les caractéristiques cliniques et la pathologie ne peuvent être distinguées.
  • Infiltration péri-vasculaire de cellules N, E, M et T CD4+ (mélange Th1, Th2, Th0) similaire à une phase retardée d’une réaction allergique, sans différence entre l’auto-immune et l’idiopathique.
  • Basopénie dans les deux types, réduite par les stéroïdes et augmentation du nombre de mastocytes cutanés.

- Critique de ce point de vue :

  • De nombreuses données semblent conflictuelles voir contradictoires.
  • Est ce qu’une affection dont les sous-ensembles sont cliniquement et pathologiquement identiques peut être le résultat de deux causes complètement différentes.

ASST+/HRA+ : auto-immune
ASST+/HRA- : auto-réactive ? auto-immune ?
ASST-/HRA- : idiopathique

- Est-il possible que les AC à l’origine de la pathologie auto-immune ne soient pas détectés dans 50% des cas ?
- et que ces mêmes AC soient détectés dans plusieurs autres conditions aussi bien que chez des sujets normaux ?

APST (autologue plasma skin test) : nouveaux éléments in vivo.
- Nous sommes partis de l’observation que quelques urticaires chroniques étaient ASST-/APST+ (Na citrate).
- Dans une étude systématique sur 71 sujets atteints d’urticaire chronique, 86% étaient APST+ vs 53% ASST+.
- Seuls ceux qui réagissaient le plus fortement à APST étaient aussi ASST+.
- Aucun patient n’était ASST+/APST-.
- Les sujets contrôles normaux étaient APST-.

- Le plasma contient des facteurs associés à la réactivité autologue de la peau.
- De tels facteurs sont également présents dans le sérum seulement si leur concentration plasmatique est élevée.
- Puisque le sérum et le plasma diffèrent essentiellement par la présence de facteurs de la coagulation, les auteurs ont étudié la cascade de la coagulation.

Thrombine et urticaire : existe-t-il une relation ?
- Constatations :

  • Le taux de Prothrombine (fragment 1+2) était plus élevé chez les patients par rapport au groupe contrôle.
  • Le taux de Prothrombine (fragment 1+2) était plus élevé chez ASST+/APST+ vs ASST-/APST+.
  • Le taux de Prothrombine (fragment 1+2) était directement relié à la sévérité de l’urticaire.

- Au total, l’urticaire chronique est associée à la génération de thrombine.

  • C’est une sérine protéase capable dans des modèles animaux d’activer des mastocytes et de provoquer de l’oedème par une augmentation notable de la perméabilité de l’endothélium.
  • De tels effets sont très réduits par les antihistaminiques.
  • Ces effets sont totalement abolis si l’on fait une déplétion totale en mastocytes.
  • de récents travaux ont montré que la thrombine est capable de générer du C5a en l’absence de C3, shuntant ainsi complètement la première voie d’activation du complément.

- Deux sous populations ont été mises en évidence :

  • Vis à vis de F1+2
    • Niveau élevé de F1+2 (activité clinique modérée à sévère dans 82% des cas)
    • Niveau normal de F1+2 (activité clinique modérée à sévère dans 35% des cas)
  • Vis à vis de D-dimère (dont les niveaux moyens sont plus hauts dans l’UC que chez les contrôles)
    • 8/37 ont eu des niveaux augmentés (activité clinique modérée à sévère dans 75% des cas)
    • 29/37 ont eu des niveaux normaux (activité clinique modérée à sévère dans 38% des cas)
  • Pour F XIIa, valeurs normales chez les patients et les contrôles.
  • Pour F VIIa : niveau moyen supérieur chez les patients par rapport aux sujets contrôles.
    Il existe une relation significative entre le taux plasmatique de F VIIa et celui de F1+2.

- Conclusion : l’activation de la coagulatiion se passe par la voie extrinsèque.

Les auteurs ont donc étudié l’expression du facteur tissulaire.
- Biopsies : seules les cellules des patients exprimaient le facteur tissulaire.
- Ces cellules n’ont pas été caractérisées plus avant.
- Mais notre identification préliminaire d’éosinophiles a été confirmée ultérieurement.
- Dans l’urticaire chronique très sévère, on a des niveaux très élevés de D-dimères et de F1+2.
- Une rémission a été contemporaine d’une chute très marquée de ces deux facteurs.
- L’urticaire chronique est fréquemment associée à une activation de la voie extrinsèque de coagulation

Conclusions
- L’UC est fréquemment associé avec l’activation de la voie extrinsèque de la coagulation.
- L’activation de la cascade de la coagulation suit en parallèle l’activité de la maladie ; dans les cas sévères, il y a formation de fibrine et fibrinolyse.
- Le rôle pathogénique d’une telle activation n’est pas encore clair.
- Les résultats APST/ASST semblent dépendre d’avantage de l’activation de la coagulation (thrombine ?) que de la présence de Ab-a-FceRI ou Ab-a-IgE.


Allergo-informatique. Utilisation de la bioinformatique dans l’approfondissement de nos connaissances en allergie et en allergènes.

Daniel Soeria-Atmadja - Uppsala

Qu’est ce que la bioinformatique ?
- la bioinformatique connecte la biologie, les mathématiques, l’informatique, les statistiques et les technologies de l’information.
- cela inclus le stockage d’informations biologiques dans des bases de données.

- Le développement d’algorithmes permet de révéler des similarités, des profils ou des relations au sein de grands ensembles de données multivariées.
- Elle permet la classification, voir la prédiction dans différents systèmes biologiques.

L’analyse des protéines allergènes en bioinformatique : bases de données, comparaisons d’allergènes, prédiction d’épitopes, évaluation du risque.
- Bases de données d’allergènes : stockage d’infos cliniques ou moléculaires
- Allergome est actuellement la plus adaptée.
- Allergenonline ( FARRP) Informall (aliments)

On représente les séquences d’AA par des représentations linéaires mais de plus en plus de représentations 3D.

Comparaison entre les allergènes
- Alignements : il s’agit de la mesure de la similarité de deux séquences : c’est un outil essentiel en allergologie moléculaire.
- Identifications de motifs ou d’épitopes.
- Grouper les allergènes en catégories.
- Évaluation de risque, du potentiel allergénique dans les aliments issus des OGM.

Il existe plusieurs outils basés sur des critères FAO/WHO.
- Evaller est basé sur la similarité de peptides issus d’allergènes.
- Bioinformatique et identification des corrélations sérologiques.
- Base de données sur IgE réactivité (Phadia)

  • Cette base contient des dosages d’IgE sériques de plus de 1000 sujets polysensibilisés, screenés vis à vis de 89 allergènes différents, ce qui donne environ 90000 mesures...
  • On peut en déduire 12 clusters stables :
    • Cluster 1 : fungi
    • Cluster 2 : pollens d’herbacées
    • Cluster 3 : acariens
    • Cluster 4 : pollens d’herbacées et d’arbres
    • Cluster 5 : pollens d’arbres et pomme
    • Cluster 6 : epithelium / phanères
    • Cluster 7 : aliments d’origine animale
    • Cluster 8 : poissons
    • Cluster 9 : fruits de mers et insectes
    • Cluster 10 : pollens de Graminées.
    • Cluster 11 : Aliments d’origine végétale
    • Cluster 12 : noix et légumes
  • Cluster acariens et cluster fruits de mer et insectes sont distincts, ce qui peut surprendre : la tropomyosine n’est pas la seule protéine en cause...
  • On peut également faire des cartes d’allergènes, toujours basés sur plus de 1000 sera.
  • On constate à peu près la même chose c’est à dire combien ces différentes classes sont proches les unes des autres.
  • Si on se limite aux aliments végétaux, aux pollens et aux venins d’hyménoptères on a une bien meilleure résolution.

Directions futures :
- Inclusion des données cliniques
- Inclusion des composants naturels et recombinants.
- Précision des allergènes pertinents pour telle ou telle sous population
- Inclusion des mesures des taux d’IgG1 et IgG4, des données d’haplotype HLA classe II et/ou récepteurs pour cellules T.


La base de données AllFam

Cristian Radauer – Vienne

Contexte :
- Des centaines d’allergènes ont été identifiées et séquencés dans les deux dernières décades.
- Cette grande quantité de données permet de classer les allergènes selon la biochimie et l’évolution.
- Des études antérieures ont montré que la plupart des allergènes appartiennent à un nombre réduit de familles.
- Cependant la plupart des bases de données groupent leurs allergènes par source.

Objectif :
- Nous avons développé AllFam, une base de données de familles d’allergènes protéiques, qui combine des informations sur la collection d’allergènes la plus adaptée, allergome, et des informations tirées de la base Pfam sur les familles de protéines.

Méthodes :
- Un set de données sur des allergènes dont les séquences protéiques sont connues, à raison d’un seul isoforme par allergène, a été généré par allergome.
- Des données sur les familles de protéines ont été tirées de Pfam, une base de données suisse, qui inclut les séquences d’Uniprot.
- La base de données AllFam combine ces données sur les familles de protéines avec l’exposition et les sources d’allergome.
- De plus, la base de données contient une feuille de calcul pour chaque famille d’allergènes (propriétés biochimiques et pertinence allergologique).

Résultats :
- Allergome contient 824 séquences d’allergènes (sans inclure les isoallergènes).
- Ces séquences ont été classées en 175 familles de protéines.
- Seules 92 familles contiennent plus d’un allergène.
- La famille d’allergènes la plus abondante est la superfamille des prolamines, puis viennent ensuite les profilines et la famille des « EF-hand ».

Conclusion :
- AllFam constitue un moyen de classement biochimique des allergènes .
- C’est une aide à la compréhension de l’allergènicité en général et à la prédiction de l’allergènicité (par exemple pour les aliments issus d’OGM) en particulier.
- Cette base de données est accessible à l’adresse suivante : http://www.meduniwien.ac.at/allerge...


Technologie Multiplex. Nouvelles perspectives pour la détection d’allergènes environnementaux

Eva King – Charlottesville

Les mesures de sensibilisation et d’exposition sont difficiles à réaliser dans les études épidémiologiques.

De quels moyens disposons nous ?
- Mesure d’une sensibilisation :

  • in vivo SPT
  • in vitro RAST
  • ELISA
  • FEIA

- Mesure d’une exposition : Comptes d’acariens, de blattes, de chats, de moisissures, etc...

FMAT = fluorescent multiplex array technology
- Permet des mesures multiples dans un seul test.
- Fournit des données quantitatives, une standardisation et une efficience améliorée.
- Est flexible, de nouveaux tests peuvent être ajoutés ainsi que des combinaisons personnalisées.
- Convient pour des allergènes et la détection des moisissures et des anticorps IgE.
- La technique en pratique :

  • Billes de polystyrène de 5.6µm fluorescentes couplées avec des anticorps monoclonaux ou des allergènes, incubées avec des échantillons.
  • Détecte les allergènes par fluorescence.
  • Les billes sont dirigées vers l’axe optique d’un cytomètre de flux.
  • Une réponse rouge identifie un allergène spécifique.
  • Une réponse verte (laser vert) quantifie l’allergène ou l’IgE liée.
  • 100 billes de chaque type sont comptées pour une bonne représentativité.
  • Le signal fluorescent est quantifié pour évaluer la concentration allergénique.

Multiplex array pour les IgE totales et spécifiques :
- Validé par exemple pour Der p 2 contre ELISA, avec une excellente corrélation.
- Même résultat « contre » immuno CAP, sauf bien entendu si on utilise un mélange d’allergène ; le multiplex n’utilise, lui, que des allergènes.
- Le temps nécessaire à l’examen d’une centaine de sera est d’environ 6 heures pour multiplex, 22 heures pour immunoCAP et 55 heures pour ELISA.
- Le volume de sérum nécessaire en Multiplex est de l’ordre de 20µl, il est de 440µl en immunoCAP et de 660µl en ELISA.

Multiplex array pour la mesure de l’exposition allergénique :
- On ne peut utiliser que des allergènes purifiés.
- D’où la nécessité de définir des standards universels d’exposition selon les différentes molécules :

  • Der p 1, 2500 ng/ml
  • Der f 1, 2500 ng/ml
  • Der p 2, 2500ng/ml
  • Fel d 1, 1300 ng/ml
  • Can f 1, 5000 ng/ml
  • Bla g 2, 4000 ng/ml
  • Mus m 1, 250 ng/ml
  • Rat n 1, 1000 ng/ml

On a une sensibilité 10 fois plus grande en multiplex qu’en ELISA.

La reproductibilité ne pose aucun problème semble-t-il.

Applications :
- Études épidémiologiques d’exposition et de sensibilisation.
- Études pédiatriques de sensibilisation allergique.