L’expérience française : aperçu sur les substances inhalées

Gabrielle Pauli

Historique :

Dissociation des allergies à la poussière de maison

• 2/3 : les allergènes viennent des acariens Dermatophagoides et 1/3 des mammifères, principalement du chat. (Pauli G. BessotJC. Hirth C. Thierry R. Dissociation of house dust allergies. A comparison between skin tests, inhalation tests, specific IgE and basophil histamin release measurements. JACI, 1979 ; 63 : 245-252)
• Pauli G. Evolution dans la compréhension des réactivités croisées des allergènes respiratoires ; le rôle des allergènes recombinants. Int Arch Allergy Immunol, 2000 ; 123, 183-95.

La première approche moléculaire peut être attribuée à une étude d’histamine release par l’albumine de chien ( Pauli G. Bessot JC. Hirth C. Roegel E. Med et Hyg 1981)

Premiers tests cutanés par la méthode des pricks (les concentrations ont été choisies à l’aide de tests d’histamine release : de 3 à 50 mcg/ml).

Bet v 1 marqueur de la pollinose au bouleau.

rBet v 1 et rBet v 2 : sensibilité 100%

Sur 45 patients, 26 réagissant à la noisette ou aux Rosacées avaient une IgE réactivité à rBet v 1.

Intérêt des tests rBet v 1 pour le rôle de la pollinose de printemps : les IgE anti Bet v 2 sont positives chez 19.5% des patients avec une médiane à 2.46 kU/l ; les syndromes oraux sont plus fréquemment observés chez les patients dont le test rBet v 1 est supérieur à 54 kU/l.

Est-il possible d’avoir une pollinose cliniquement pertinente dans l’Est de la France, reliée à une sensibilisation aux profilines ?

• Sur 117 patients, seulement 5 étaient monosensibilisés à Bet v 2 : tous étaient polysensibilisés aux pollens et aucun n’avait de symptômes en Février.
• Mais dans un cas clinique, un test de provocation par voie nasal a été positif pour un extrait de pollen de bouleau.

Une connexion continue entre les chercheurs et les cliniciens est essentielle.

Prise de conscience de l’importance du frêne dans la pollinose de printemps.

• Ce furent d’abord des tests cutanés positifs à un mélange de pollens méditerranéens chez des patients habitant le nord de la France.
• Le frêne a été inclus dans le panel de tests des aéroallergènes il y a environ 8 ans.
• De nombreux tests ont été positifs avec quelques discordances avec le RAST Fraxinus (Fraxinus americana).
• Depuis, plusieurs études biologiques nous ont beaucoup appris sur les allergènes du frêne.
• En immunoblot, beaucoup de patients reconnaissaient Fra e 1 (Maud Hrabina)
• L’allergome du frêne a été établi par Pascal Poncet.
• plusieurs études d’inhibition ont mis en évidence des réactivités croisées, notamment entre Fra e 1 et Ole e 1.
• Parmi 30 patients sensibilisés au frêne, 2/3 réagissaient à la tomate en tests cutanés.
  • La moitié d’entre eux présentait un syndrome oral.
  • Profiline positive chez un seul patient : d’autres allergènes croisants peuvent être impliqués.
• D’autres allergènes du frêne ont été précisés (Fra e 4, Fra e 9)
• L’hypersensibilité au pollen de frêne et les réactivités croisées avec d’autres pollens communs peuvent conduire à des « mirages d’allergie »
• rFra e 1, une fois disponible, sera essentiel pour tester et traiter les patients allergiques au frêne dans les régions où les frênes poussent.
• Des allergènes croisants comme Fra e 2 ou d’autres peuvent expliquer les réactivités croisées avec certains aliments.

Cas clinique J.M.B…

• 1995 : plusieurs angio-oedèmes après avoir mangé des bananes, kiwi, papaye et urticaires de contact avec latex. Sensibilisation Graminées, bouleau, Olivier, armoise et plantain sans pertinence clinique.
• 1997 : Débute une rhinite saisonnière (Avril, fin Juillet, Aout)
• 1998 : Echec complet d’une immunothérapie aux pollens de Graminées. Sévère rhinite en Aout : pollinose armoise (RAST classe 3, test de provocation nasale positif, OAS au melon et à la pastèque)
• 2000 : Symptômes importants en Avril (saison du pollen de frêne) RAST Fraxinus 7.46 kU/l, rBet v 1 nég, rBet v 2 6.53.
• La rhinite en Avril est reliée à une allergie au frêne.
• Sa « sensibilisation » cutanée au bouleau est expliquée par Bet v 2.
• Ses allergies alimentaires peuvent être expliquées par Bet v 2 (melon, banane, kiwi) béta glucanase (banane, latex, Oléacées) et chitinases (latex, banane).

Pollen de cyprès et pêche : un nouveau syndrome du Sud de la France ?

Deux études ont apportées des données :

• Hugues B, Didier Laurent A, Charpin D, réactivités croisées entre pollen de cyprès et pêche, rapport de 7 cas. Allergy 2006.
• Delimi B, Dhivert-Donnadieu H, Demoly P, Allergies cyprès-pêche : allergie croisée ou simple coïncidence. Rev Fr Allergol 2007.

Si une réactivité croisée peut ici être évoquée, voire suspecté, il manque des études d’inhibitions, pouvant seules apporter la preuve d’une possible réactivité croisée ; des études biologiques étaient annoncées dans la deuxième étude, dont nous n’avons pas eu connaissance des résultats

Les investigations cliniques menées par les praticiens doivent être confirmées au niveau moléculaire afin d’améliorer le diagnostic et l’approche thérapeutique.

En France, il est de coutume de transmettre l’information scientifique dans les discussions de cas cliniques avec au moins deux experts qui préparent des pré-tests, des références scientifiques et des post-tests.

Deux congrès annuels organisent ces « ateliers » sur différents sujets.

Depuis 2005, plusieurs ateliers ont traités des allergènes recombinants ainsi que des réactivités croisées.

Deux séminaires sur les recombinants ont eu lieu :

• 2004 : Strasbourg (60 participants) avec R.Valenta.
• 2007 : Bischoffsheim (15 participants français sur 120) Allergy school (parrainée par Galen, EAACI et SFAIC)

Polllinoses avec sensibilisations multiples. Atelier n°2 Allergy school, Bischoffsheim, Sept 2007.

Cas n° 1, Femme de 32 ans, rhinoconjonctivite chronique du début du printemps au début Septembre.

• Attaque d’asthme en Mai 2000 et Juin 2000
• L’exposition au chat déclenche des crises de rhinite.
• 10 ans auparavant, désensibilisation à la poussière de maison, inefficace.
• Pas d’allergie alimentaire.
• Tests cutanés positifs pour le chat et de nombreux pollens (arbres, Graminées et autres herbacées)

Est-elle allergique à tous ces pollens ?

• L’allergie au pollen de Graminées est confirmée : r Phl p 1, 5b = 58kU/l
• rBet v 1 est négatif : pas d’allergie au bouleau.

S’agit-il de co-sensibilisation ou de réactivité croisée ?

• Profilines :
  • rBet v 2 : 8.33 kU/l
  • rPhl p 12 : 9.10 kU/l
• Protéines se liant au calcium :
  • rPhl p 7 : 9.11 kU/l

Pouvons nous connaître les allergènes croisants ?

Quelles conséquences pour le traitement ?

Pour cette allergie aux pollens de Graminées avec co-sensibilisation aux autres pollens via profilines et polcalcines (dont la pertinence clinique devrait être confirmée par des observations cliniques et/ou des tests de provocation nasale) , on peut proposer une immunothérapie avec des extraits de pollens de Graminées et un traitement symptomatique.

Réactivités croisées au sein d’aéroallergènes (acariens, blattes, silverfish) :

• Der p 10,
• Bla g 7,
• Per a 7,
• Lep s 1.

Cas clinique n° 2, André Z…, 40 ans, rhinite chronique depuis plusieurs années, exacerbée lors de l’exposition à la poussière de maison. OAS induit par l’ingestion de crevettes.

Tests cutanés : D.pter +, Crevette en natif +, Blattes +, les autres aéroallergènes négatifs.

En 2006, angio-œdème facial, malaise, chute de la pression artérielle 4heures après avoir mangé des crevettes.

Confirmation biologique de la sensibilisation à une tropomyosine (IgE 6,5 kU/l), avec une réactivité cutanée aux extraits de blattes.

Les domaines d’application de nos connaissances en matière d’allergologie moléculaire nous conduisent vers de nouveaux concepts, vers de nouvelles hiérarchies parmi les allergènes et une interprétation totalement renouvelée des polysensibilisations.

Allerdata, un site Internet comportant un dispositif original de traitement des données est déjà d’un grand secours.

www.allerdata.com est le résultat de la collaboration de contributeurs enthousiastes : des auteurs d’une revue de la littérature, des informaticiens, des praticiens allergologues et des praticiens hospitaliers universitaires.

• Aide au diagnostic de la protéine allergénique en cause dans l’IgE réactivité.
• Améliore les connaissances des molécules homologues responsables de réactivité croisées.
• Permet l’identification de familles moléculaires.
• Permet un accès aisé aux réactivités croisées déjà décrites aussi bien qu’aux études biologiques de confirmation.

Allerdata est une manière de présenter les développements de l’allergologie.

• 3886 allergènes figurent dans la base de données www.allergome.org
• Permet de « rattraper » 10 ans de recherche et de penser différemment.
• Améliore le diagnostic en vue d’améliorer la prise en charge thérapeutique.

Au total, www.allerdata.com est un site Internet mettant en ligne et interprétant la revue de la littérature réalisée par Henri Malandain :

A utiliser à tout moment, où que vous soyez !...

Allerdata est un logiciel de diagnostic des réactivités croisées :

Les cas cliniques présentés dans cet exposé auraient pu être analysés de façon intéressante par Allerdata, mais, bien sûr, ce sera toujours à l’allergologue d’établir le diagnostic.

Les allergènes recombinants : une nouvelle aventure aussi pour les cliniciens !

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Etat actuel du diagnostic allergique en Amérique du Nord

Robert G Hamilton

Robert G Hamilton est responsable de la biologie au Johns Hopkins hospital et a beaucoup publié sur le diagnostic biologique des maladies allergiques ; il est donc intéressant d’avoir son point de vue.

Le diagnostic est un processus mental dans lequel une information imparfaite sur l’histoire clinique et des informations de laboratoire sont utilisées pour en déduire une probabilité de l’existence d’un état pathologique (Gendo, Larson : Evidence based diagnostic strategies for evaluating suspected allergic rhinitis. Ann Intern Med 2004 ;140-278-289).

L’American Academy of Allergy, Asthma and Immunology (AAAAI) a élaboré un algorythme diagnostic pour les maladies allergiques :

• Histoire clinique et examen clinique : symptômes, expositions, facteurs de risque.
• Diagnostic de la sensibilisation IgE : SPT, sérologie IgE (les termes exacts sont : allergen-specific IgE antibody serology)
• Test de provocation : inhalation, ingestion ou injection (exposition naturelle versus exposition contrôlée).

En pratique, la démarche diagnostique est au sein d’un système complexe :

• patient :
  • Reconnaissance des symptômes : biais de la mémoire.
  • Environnement : domicile, animaux de compagnie, habitudes.
  • Exposition allergénique : durée et voie d’exposition.
  • Démographie : âge, histoire de l’atopie.
  • Prévalence de la maladie allergique.
• Allergologue :
  • Education, pratique, expérience.
  • Echelles d’examen clinique.
  • Questionnaire, check listes pour l’histoire.
  • Interprétation différentielle, connaissances sur les allergènes.
• Tests cutanés de confirmation
  • Méthode de tests cutanés
  • Prick, IDR
  • Dispositifs, technique
  • Réactifs : extraits allergéniques, natifs
  • Facteurs liés au patient
  • Staff technique
  • Facteurs du système, enregistrements.
• Tests IgE de confirmation
  • Méthode des tests
  • Sensibilité analytique, automatisation
  • standardisation, reproductibilité
  • Réactifs
  • Staff technique, éducation, entraînement
  • Facteurs liés au laboratoire : certification, enregistrements.

Situation avant 2001 :

	IgE	SPT	IDR
Réactions systémiques	pas envisagé	sensibilité insuffisante	préférée
Allergie aux venins	utile	sensibilité insuffisante	préférée, venins jusqu’à 1µg/l
Allergie médicamenteuse	sensibilité faible	sensibilité insuffisante	préférée

Un événement a tout changé.

Il s’agissait d’une erreur diagnostique dans un problème d’allergie au venin, le jugement rendu : 5 millions de Dollars.

• Ce cas était celui d’un dentiste de 29 ans de Seattle, golfeur.
• Histoire de réactions systémiques aux « yellow jacket ».
• IDR négative à 1µg/l pour les 5 venins d’Hyménoptères testés.
• Le diagnostic s’est basé sur les explorations et non sur l’histoire clinique.
• Quelques semaines plus tard : anaphylaxie suivant une piqûre de Vespidée, avec, comme conséquence, un état végétatif…
• Les IgE anti-venin de « yellow jacket » étaient positives dans le sérum collecté immédiatement après l’anaphylaxie.
• L’intervalle de temps entre la piqûre et l’épinéphrine a été identifié comme critique pour la réversibilité de la réaction.
• Les tests cutanés négatifs n’avaient pas été refaits, de même que la sérologie IgE.
• Peu de données sur la reconstitution du venin ayant servi pour le diagnostic, peu de connaissance et de pratique pour la personne qui a pratiqué les tests.

De ce cas (Golden, Kagey-Sobotka, Hamilton et al, Insect sting allergy with negative venom skin test responses. JACI 107 : 897-901, 2001) on peut déduire quelques messages :

• Les IDR au venin peuvent être négatives chez des patients qui vont par la suite présenter d’autres réactions systémiques consécutivement à des piqûres d’insectes.
• Les IDR au venin sont négatives chez des patients (jusqu’à 1/3 de ces patients) ayant une histoire de réactions allergiques aux piqûres d’insectes et peuvent être associées avec des réponses IgE positives vis-à-vis des venins.
• Il faut répéter les tests cutanés négatifs et faire une sérologie IgE.
• La sérologie est importante dans l’algorithme diagnostic mais l’histoire doit rester la base principale du diagnostic.

Le tableau ci-dessus change un peu…

	IgE	SPT	IDR
Réactions systémiques	pas envisagé	sensibilité insuffisante	préférée
Allergie aux venins	complémentaire des TC IDR	Sensib insuff	de préférence, jusqu’à 1µg/ml
Allergie médicamenteuse	complément des TC IDR	Sensib insuff	de préférence
Réact systémique latex	sensib rHev b 5 75-85%	pas dispo	pas dispo

En pratique le diagnostic allergique est régi par la FDA, « bureau of Biologics » pour les réactifs in vivo :

• Les extraits pour tests cutanés aux USA sont des mélanges d’allergènes bruts réglementés, avec des spécifications de performances limitées ou des dates limites.
• Les nouveaux extraits pour le diagnostic cutané sont tenus à respecter des normes plus exigeantes dans les études cliniques requises.
• Les allergènes recombinants ou purifiés sont destinés à la recherche ou à des enquêtes : ils sont classés IND (investigational new drug).
• Les réactifs utilisés pour les tests de provocation en clinique ne sont pas bien réglementés.

Et par le « Bureau of devices », le bureau des dispositifs, pour les réactifs in vitro.

Les tests sérologiques pour les IgE sont approuvés par la branche « dispositifs » de la FDA.

Ils doivent montrer des caractéristiques de performance équivalentes aux tests de référence (Phadebas RAST).

Quelques réactifs peu ou non documentés quant à leur contenu en allergène sont utilisés dans des tests sous le contrôle de la règle ASR (analyte specific reagent).

Evolution des tests IgE manuels en Amérique du Nord

• Phadebas RAST (Pharmacia) disc allergosorbent 1. 1968.
• Hycor Hy-Tec (paper disc based)
• FAST : Allergenics/Biowhittaker, fluorescent allergosorbent test.
• MAST : Hitachi : thread pipette
• EAST : Sanofi Diagnostics Pasteur
• Magic lite : ALK/Corning/Bayer
• Matrix : Abott

Evolution des tests IgE semi-automatisés en Amérique du Nord

• Alastat, Diagnostic Products Corp. (biotinylated-allergen)
• AutoCAP, Pharmacia (allergen insolubilized on sponge).

Evolution de la technologie des tests IgE spécifiques.

• ImmunoCAP (250, 1000) : Phadia (Pharmacia, Jan 06) – 76%
• Immulite 2000/2500 : Siemens Medical solutions Diagnostics (DPC-Jan 07)-21%
• Hy-Tec-288 : Hycor-Stratagene-Agilent (June 07)-3%

Futurs tests IgE

• Immuno Solid Phase Allergy Chip ISAC : VBC Genomics
• Lateral Flow (over the counter) IgE antibody Assays

Selon l’étude de Woods RA, et al, Accuracy of IgE antibody laboratory results, Ann Allergy Asthma Immunol 2007 ;99:34-41) CAP, Immulite et Hy-Tech mesurent différentes populations d’anticorps.

Si l’on revient au tableau de l’usage des tests de confirmation :

	IgE	SPT	IDR
All. alim. réact. systémiques	largement utilisé (pédiatrie)	largement utilisé (adultes)	inutile. Faux +

Probabilité du risque de survenue d’une maladie allergique :

• Œuf : 7kUI/l
• Lait de vache : 15kUI/l
• Arachide : 14kUI/l
• Poisson : 10kUI/l

Ce sont les fameux « seuils » de Sampson, publiés dans le JACI, et largement commentés depuis…

Le tableau de l’usage des tests de confirmation peut alors être complété :

	IgE	SPT	IDR
All. respiratoire	Acceptable sens 61-94%, specif 70-100%	Acceptable sens 94-97%, specif 81-92%	Inutile en général. Faux +

« Gold standard » utilisés pour juger la performance des tests IgE :

• « gold standard » clinique : Corrèle les symptômes du patient avec des critères cliniques établis par des experts. (sujet à des biais, facile à utiliser).
• « gold standard » composite : combine l’histoire et l’examen clinique avec un ou plusieurs tests IgE de confirmation (tests cutanés, tests in vitro) (surestimation de l’index sens/specif).
• « gold standard » test de provocation : combine l’histoire et l’examen clinique avec les résultats de tests de provocation
  • Seuils différents selon la sensibilité des organes
  • Manque de standardisation des méthodes et de l’évaluation des résultats.
  • Des doses plus importantes d’allergènes que dans les conditions naturelles sont souvent nécessaires pour déclencher une réponse cliniquement mesurable.

Sodderstrom Allergy 58 :921, 2003, s’était penché sur les variations de courbes de probabilité en fonction des données cliniques, des différents « allergènes » et des prédispositions de l’allergologue.

En pratique, aux USA, les exigences fédérales pour les laboratoires de diagnostic allergologique :

• Doivent avoir une licence validée par le « Clinical laboratory improvement », acte de 1988.
  • Cela concerne environ 150 laboratoires.
  • Les exigences concernent l’expérience, les connaissances, la certification de l’équipe, la formation continue, les enregistrements et le contrôle qualité en interne.
• Doivent participer avec succès à un programme d’évaluation inter-laboratoires (avec une inspection tous les 2 ans).
  • 5 sera sont envoyés toutes les 17 semaines (3 par an) aux 150 laboratoires certifiés CLIA-88.
  • Chaque sérum est analysé pour les IgE totales et des IgE spécifiques vis-à-vis de 5 allergènes probablement vis-à-vis de 5 produits allergisants
  • Les résultats sont reportés en kUI/l pour les IgE totales ou en kUa/l pour les IgE spécifiques selon les standards IgE de l’OMS et en classes.

Evaluation clinique de la réponse immune humorale chez les patients atopiques.

Plus que des IgE totales ou des non-IgE spécifiques des « allergènes » (IgG/IgA), nous évoquerons surtout les IgE spécifiques :

• Elles confirment la sensibilisation en complément des données de l’histoire et de l’examen.
• Elles vérifient la spécificité dans des traitements planifiés.
• Elles procurent une mesure de la concentration en anticorps IgE, qui peut avoir une valeur prédictive dans certains cas.
• Dans le futur, seront pris en compte : concentration en IgE, spécificité, affinité, clonalité, réactivité croisée, ratio IgE spécifique/IgE totales.

Enfin si on avait une boule de cristal…Peut être y verrait-on des tests basés sur des extraits complétés par des tests basés sur des allergènes multiples avec des algorithmes de décision…

Relations entre les niveaux d’IgE spécifiques et les IgE totales :

• 1 kUa/l d’IgE spécifiques est équivalent à 1 kUI/l d’IgE totales comme mesuré en Phadia ImmunoCAP.
• On peut donc estimer le rapport IgE spécifique/IgE totales dans le sérum…

Recommandations aux professionnels de soins américains :

• La méthode du test IgE doit être précisée : les unités ne permettent pas d’identifier la méthode.
• Connaître la validité générale de la méthode de test pour pouvoir interpréter avec précision les résultats des tests dans le contexte de l’histoire clinique.
• Connaître la maîtrise du laboratoire pratiquant le test (La certification fédérale CLIA-88 n’est pas une référence parfaite ; des données d’études de maîtrise inter laboratoires peuvent être utiles)
• Aucun laboratoire, aucun membre de l’équipe du laboratoire n’est infaillible ; répéter les tests en cas de discordance avec l’histoire.

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L’expérience italienne : nouveaux outils diagnostiques et nouvelles technologies

Adriano Mari

Qu’avons-nous appris depuis 2 ans ?

La recherche actuelle est une recherche de transition entre les tests cutanés et la biologie « classique » et les futurs chips (par exemple ISAC,Immuno Solid-Phase Allergen Chip de VBC-Genomics).

• Il s’agit d’un microtest de détection des IgE.
• Ses dimensions sont réduites (7mm sur 7mm)
• Les IgE sériques sont mises en contact avec des allergènes et révélées par des anti-IgE (fluorescence).

Cette technologie a permis de faire une mimique d’extrait de pollen de Graminées.

En 96, Extrait de chien contaminé par des allergènes d’acariens (D.ptero).

A Rome, nous avons des extraits diagnostiques pour l’ambroisie et pas pour le cyprès…

L’évaluation des chips ne passe pas par les extraits.

On a recherché des corrélations, molécules par molécules ; avec un chip, on teste tout, sans discrimination.

Il faut bien sûr un protocole pour une épidémiologie des IgE réactivités vis-à-vis de toutes les sources.

Actuellement, certains pays font moins de tests cutanés que d’autres et d’une manière générale, il y a une grande hétérogénéité dans la pratique des tests cutanés.

Si vous testez 89 allergènes, vous aurez un certain nombre de sensibilisations sans signes cliniques ; de plus, le profil de réactivité vis-à-vis des allergènes du kiwi n’est pas le même dans une population allergique à Anisakis ou dans la population générale.

Ce qu’on apprend aussi des chips c’est ce qu’est une molécule hypoallergénique.

• IgE réactivité sur des échantillons sélectionnés.
• Activation des basophiles.
• PBMC prolifération.

On a ainsi pu mettre en évidence un isoforme de Bet v 1 incapable d’entraîner une réponse IgE chez des sujets allergiques au pollen de bouleau.

En pratique, il suffit de 20 microlitre de sérum donc il n’est pas nécessaire de discriminer ; cela n’augmente pas le coût de la biologie.

Cette méthode de diagnostic individuel peut permettre des études épidémiologiques dans le monde entier.

Les chips sont sujets à une réactivité CCD car ils comportent des allergènes recombinants et des allergènes naturels : on peut reconnaître la protéine ET les CCD…

Les premières données tirées des chips montrent qu’il existe un profil de réactivité en fonction de la pathologie.

Beaucoup de travail reste à accomplir en matière de relevance des IgE réactivités à tel ou tel allergène et, de façon plus générale, pour faire le lien avec la clinique.

Faut-il ne prendre en considération un résultat biologique que s’il s’accorde avec la clinique ?

Mais qu’il n’y ait pas d’histoire actuelle veut-il dire qu’il n’y en aura pas ?...

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Etudes de populations basées sur les allergènes domestiques : que pouvons nous en apprendre ?

Martin Chapman

Exposition aux allergènes d’acariens et asthme de l’enfant.

Pour une exposition supérieure à 10microg de Der p 1, on retrouve une association avec asthme et wheezing à l’âge de 11 ans (Sporik et al, NEJM 323 :502-507, 1990).

Richard Sporik, décédé en Mars 2008, a largement contribué à améliorer nos connaissances dans les rapports entre exposition et sensibilisation :

• Exposition précoce et asthme (NEJM, 1990)
• Allergènes des acariens et asthme (CEA, 1992)
• Allergènes de chat/chien et asthme (AJRCCM, 1995)
• Seuils d’exposition aux allergènes et sensibilisation (Thorax, 1999)
• Modification des réponses Th2 au chat (Lancet, 2001)

Etude Néo-zélandaise longitudinale de cohorte portant sur l’asthme infantile (Sears et al, NEJM, 2003 :329 :1414-22)

Des tests cutanés positifs à 13 ans sont un facteur de risque pour la survenue d’un asthme.

Gruchalla et al (JACI 115 :478, 2005) a étudié l’asthme en milieu urbain et retrouvé, chez 937 enfants âgés de 5 à 11 ans, environ 80% de sensibilisations aux blattes (Bronx, New-York, Dallas) et 80% de sensibilisations aux acariens (Dallas, Seattle) qui correspondent à des expositions supérieures à 2U/g pour Bla g 1 (Bronx, New-York, Chicago) et à des expositions supérieures à 2microg/g pour Der p 1 (Dallas, Seattle).

Arbes et al (JACI 114 ;111-7, 2004) Etude nationale d’exposition aux allergènes dans les foyers américains.

23% des foyers américains, soit plus de 22 millions de domiciles contiennent plus de 10microg/g d’allergènes du groupe 1 des acariens.

En 2008 (JACI 212 ;678-84) Salo et al ont mis l’accent sur l’association de l’asthme et de nombreuses expositions allergéniques.

Zock et al (JACI 118 ;682-90, 2006) se sont intéressé à la distribution de Der p 1 et Der f 1 en Europe.

Eggleston et al (JACI 1998 ;102 :563-70) ont étudié les relations doses-réponses entre sensibilisation et exposition aux blattes.

D’une manière plus générale, on peut déterminer des seuils d’expositions pour la survenue d’une sensibilisation :

• Der p 1, Der f 1 : 2-10 microg/g
• Fel d 1 : 1-10 microg/g
• Can f 1 : 1-10 microg/g
• Bla g 1 : 1-8 U/g
• Bla g 2 : >1 microg/g
• Mus m 1 : 1-2 microg/g

Avec le chat, c’est plus compliqué…

Deux études à retenir sur le sujet : Platts-Mills et al (Lancet, 2001) et Custovic et al (JACI, 2001 ;108 :537-539)

Et des conclusions parfois dérangeantes : si vous êtes exposés à plus de 23 microg/g de Fel d 1, vous avez moins de chance d’être sensibilisé…

O’Hallaren (NEJM 1991) Peat (CEA 1993) Halonen (AJRCCM 1997) et Bush (JACI 1999) s’étaient penché sur Alternaria.

L’exposition à Alternaria (les allergènes majeurs sont Alt a 1 et Alt a 2) est un facteur de risqué pour l’asthme de l’enfant, et notamment pour des attaques d’asthme sévères.

Ceci a surtout été observé en climat aride (désert Australien, Midwest et Arizona pour les USA).

Salo et al (JACI 2005) ont rapporté les résultats de l’enquête nationale NSLAH.

La poussière de maison des foyers américains est riche en allergènes d’Alternaria.

Compte tenu de la forte réactivité croisée entre Alternaria et d’autres moisissures, les résultats de mesures d’expositions peuvent concerner d’autres moisissures qu’Alternaria.

Effets médicaux de l’exposition aux moisissures :

• pathologie par allergie, infections et toxicité (ingestion de mycotoxines).
• Peu de preuves d’effets néfastes par inhalation de mycotoxines ou de dysfonctions immunes causés par les mycotoxines.
• Les tests IgE vis-à-vis des allergènes de moisissures sont utiles pour le diagnostic.
• Rôle limité dans les évaluations environnementales.

Mise à jour à propos des technologies multiplex :

MARIA : Multiplex ARray for Indoor Allergens est une technologie qui concerne 10 allergènes et les IgE totales.

Earle et al (JACI 2007) ont trouvé d’excellentes corrélations entre MARIA et ELISA pour ce qui concerne les allergènes d’intérieur.

En pratique, l’adjonction de nouveaux allergènes ne modifie pas le calendrier du système Multiplex alors que cela alourdit notablement celui de la technique ELISA.

Une étude multicentrique internationale avec MARIA est en cours actuellement et ses premiers résultats sont attendus pour Juin 2008.

Evaluation de l’exposition allergénique et qualité de l’air intérieur.

• L’exposition aux allergènes devrait faire partie des investigations IAQ des patients allergiques.
• Les techniques ELISA ou Multiplex fournissent des données quantitatives sur les niveaux d’exposition.
• Des tests rapides peuvent être utilisés sur site par des personnels IAQ.
• La technologie Multiplex convient parfaitement pour :
  • La recherche (Epidémiologie, études de cohortes)
  • Le monitoring d’études d’éviction allergénique.
  • Des analyses commerciales de routine

Qu’est ce qui marche en matière d’éviction ?

• Conditions « allergènes free » (par ex : hautes altitudes)
• Housses de matelas, d’oreillers.
• Laver les literies, les chats et les chiens.
• Réduire l’humidité.
• Enlever les tapis.
• Acaricides, acides tanniques, produits chimiques.
• Nettoyage à la vapeur, aspiration intensive.
• Insecticides (blattes).

Une étude de Morgan et al, (NEJM, 2004) a montré que les interventions avaient un effet significatif.

Quelles leçons peut-on en tirer ?

• Les diverses mesures peuvent être validées.
• Des procédures efficaces ont été développées pour le contrôle de la plupart des allergènes.
• Une éviction efficace suppose une approche sur plusieurs fronts…
• Les études sont difficiles à mettre en place (avec un léger problème pour le placebo…)

Critères de pondération de l’importance des allergènes inhalés (Chapman et Aalberse, 2008, in press)

Les allergènes (qui font une différence) ont/sont :

• Une proportion significative de protéine extractable de la source.
• Une cause de sensibilisation (>2ng IgE spécif/ml) chez 80% des patients allergiques.
• représentent une proportion significative (>10%) des IgE totales.
• Réduisent la puissance de l’extrait quand on les enlève.
• Utilisés comme marqueurs pour l’évaluation de l’exposition environnementale.
• Cibles immunodominantes pour les anticorps et les réponses cellulaires.
• Activité biologique puissante : relarguage de médiateurs des cellules effectrices.
• Cibles thérapeutiques efficaces, utilisées dans des vaccins de l’allergie.

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Protéines, peptides et IgE reconnaissance

Rob Aalberse

Il s’agit toujours de répondre plus ou moins à la question : « qu’est ce qui fait d’un allergène un allergène ? »

La technique de l’ « epitope grafting » avait déjà été évoquée à Rome dans les précédentes éditions de l’ISMA.

Dans l’ « epitope mapping », on ne parle que de peptides, certes plus petits que les protéines mais malheureusement parfois plus compliqués.

Dans la technique des peptides chevauchants (« overlapping synthetic peptides »)la séquence entière de la protéine est synthétisée sur un support de cellulose sous la forme de peptides courts se chevauchant.

On s’intéresse bien sûr aux relations peptides – anticorps (IgE versus IgG4).

Les peptides purifiés sont une meilleure solution que les peptides de synthèse.

Un peptide de 25 acides aminés peut être « conformé » spatialement, mais c’est différent d’une protéine.

On peut coupler ces peptides mais cela affecte la liaison avec les anticorps : on préfère donc bloquer l’extrémité.

Les résultats qu’on obtient en Western blot ne sont pas corrélés avec la réactivité des oligopeptides.

Par exemple, Der p 2 marche très bien en Western blot, tandis que la réactivité avec des oligopeptides n’est démontrable qu’occasionnellement (Van’t Hof et al, Mol Immunol. 1991 ;28 :1225).

Florine Van Milligen et al ont publié en 94 dans le JACI une étude sur les épitopes de Fel d 1 par la méthode des peptides synthétiques chevauchants.

Cette équipe s’est intéressée aux liaisons de ces peptides synthétiques avec des IgE et des IgG4.

Laliaison peptides-IgE ne représente qu’une très faible part de la liaison observée avec la protéine Fel d 1 intacte.

Il faudrait faire des tests d’inhibition, rarement faits en pratique.

Sur 12 sera, quelques uns ne sont réactifs à aucun peptides.

Pour démontrer la spécificité de la liaison anticorps-peptides synthétiques, il faut :

• Une liaison faible aux peptides contrôles
• Une liaison faible par les contrôles à haut niveau d’IgE totales.
• La phase solide ne convient pas : il faut une inhibition par des peptides solubles d’une liaison IgE à des peptides couplés et d’une liaison IgE à des allergènes couplés.
• Il faut également une inhibition par allergène soluble de la liaison IgE avec un peptide couplé.
• En matière de spécificité, l’élution est le meilleur procédé : on étudiera par exemple l’élution par Fel d 1 d’IgE liées à des peptides de Fel d 1.

La liaison peptide-anticorps est plus faible que pour la protéine en raison du manque de structure. L’affinité est très faible.

Prenons maintenant le cas d’Ara h 2 : on change de sujet mais on parle toujours de peptides et d’épitopes…

L’orateur signale que les passionnés peuvent accéder à l’intégralité des données figurant dans l’article « Peanut epitopes for IgE et IgG4 in peanut-sensitized children in relation to severity of peanut allergy », disponible sur le site www.jacionline.org

La comparaison microarray et Phadia CAP retrouve une bonne corrélation pour l’arachide entière…Mais ce qu’on veut tester, c’est des peptides !

L’étude a concerné 30 sera ; au milieu d’un certain bruit de fond, quelques peptides émettent un signal.

On a sélectionné les 6 sera les plus réactifs.
Si on observe une positivité pour un peptide, on devrait observer une positivité pour les voisins (peptides chevauchants) mais ça n’est pas toujours ce que l’on observe…

Pour la liaison peptides-IgG4, les résultats sont un peu décevants :

Pas d’association avec les symptômes et de toutes façon, des liaisons faibles.

Pourquoi ? deux explications, d’une part les IgG4 ne se lient pas facilement aux peptides et l’arachide n’induit pas facilement des IgG4.

En fait les IgG4 se conduisent différemment des IgE : monovalents versus bivalents, mais il y a plus.

Van Milligen et al (Int Arch Allergy Immunol, 1994 ;103 :274) ont montré que le ratio des liaisons aux peptides/protéines est plus élevé pour les IgE que pour les IgG4.

Les IgE sont plus enclines à se lier aux peptides que les IgG4.

De plus, les sera IgE-positifs ont des taux d’IgG4 supérieurs aux sera IgE-négatifs.

Enfin, si on regarde les IgG1/4 on trouve des comportements différents pour le blanc d’œuf et pour l’arachide (Calkoven et al, 1998), sans que l’interprétation soit évidente…

Conclusion sur les peptides chevauchants :

Les peptides, ça marche (si vous avez de la chance).

Les peptides ne devraient pas être assimilés aux épitopes, même linéaires.

L’affinité est souvent plus faible, de plusieurs ordres de grandeur.

Quelques problèmes spécifiques :

• Densité de surface supérieure.
• Extensions hydrophobiques.
• Extrémités « non naturelles ».

La corrélations avec les symptômes n’est pas évidente.

Conclusions sur les IgE/IgG1/IgG4 :

Trivialement, si on casse la molécule, cela n’est pas bon pour la liaison.

Il y a des différences spécifiques d’aliments.

• Les IgG sont plus élevées chez des patients IgE positifs que chez des sujets contrôles. Ceci est vrai pour l’arachide, mais pas pour le blanc d’œuf.
• Les IgG4 sont plus abondantes que les IgG1 : vrai pour la banane et le blanc d’œuf et faux pour l’arachide.

Les peptides préfèrent les IgE aux IgG4 (ceci étant peut être du aux liaisons bivalentes des IgE versus liaisons monovalentes des IgG4)

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Variabilité conformationnelle des protéines allergéniques

Hans Brandstetter

En matière d’allergénicité, on s’est notamment intéressé :

• à la régulation de la réponse immune par la balance Th1-Th2.
• au modèle de l’action de l’allergène basée sur le structure des allergènes et des complexes avec les fragments d’IgE.

Les structures cristallographiques nous aident à comprendre, mais la structure seule ne paraît pas suffisante pour prédire qu’une protéine est allergénique.

Bet v 4 est une polcalcine contenant deux motifs EF qui aurait une structure monomérique selon des données NMR.

En chromatographie on a un mélange d’isoformes monomériques et dimériques.

Le switch entre les deux formes dépendant des conditions électrostatiques ; les dimères natifs se dissocient en monomères à force ionique élevée.

L’apparente oligomérisation de Bet v 4 dépend de la méthode d’observation utilisée.

Quels sont les facteurs d’oligomérisation ?

Certainement la température :

• à 20°C, monomères exclusivement.
• à 75°C, surtout des dimères, mais aussi des monomères.
• à 95°C, exclusivement des dimères.

Le temps aussi : si on incube plus ou moins longtemps à certaines températures (75°C par exemple), on a une apparition de dimères, puis de formes tétramériques.

On peut modéliser simplement :

N1 : état préférentiel, monomère natif stable.
N2 : état de dimère natif.

On peut induire un switch réversible en faisant varier les conditions de température.

La température conditionne vraiment ce que l’on peut observer, monomères, dimères, tétramères, octamères, …

Une représentation schématique de la structure de Bet v 4 comporte deux motifs EF qui sont liés.

On peut distinguer une forme fermée et une forme ouverte qui a tendance a reprendre une conformation fermée en s’associant à deux autres motifs.

La température et le temps aident à passer de la forme fermée à la forme ouverte.

Un SDS va induire une catalyse de cette transformation, expliquant que c’est un monomère en solution mais que l’on va retrouver un dimère en SDS.

La dynamique des protéines est importante pour comprendre les propriétés allergéniques.

Bien sûr, les températures expérimentales utilisées n’ont rien de naturel, mais le temps, lui,…