Workshop 14 : Allergènes

Cette session de la matinée du Lundi 09 Juin était entièrement dédiée aux conceptions actuelles en matière d’allergènes et d’allergénicité. A l’heure de l’allergologie moléculaire, le thème choisi était incontournable… L’Autrichien Heimo Breiteneder, l’Italien Adriano Mari et enfin l’Espagnol Javier Cuesta-Herranz ont, chacun à leur tour, témoigné de l’intérêt et de la diversité de cette question.

Allergènes : évolution, structure et fonction biologique

Heimo Breiteneder

Les allergènes ne sont pas séparés du monde des protéines ; Ils y sont inclus en tant que partie de grands groupes de molécules ayant un lien commun.

L’allergénicité est donc une des conséquences de millions d’années d’évolution des protéines, et très vraisemblablement, c’est une caractéristique plutôt rare parmi les protéines.

Api g 1est un des allergènes bien connus du céleri ; cette molécule a un homologue chez une bactérie commensale, Strepococcus.

De ces deux molécules, l’une est un allergène et l’autre non et il est bien difficile d’expliquer pourquoi…

Cette allergénicité des protéines n’a pas encore livré ses secrets : nous en sommes au stade des hypothèses de travail.

Heimo Breitenender nous fait part d’une de ces hypothèses : la potentialité allergénique d’une protéine ne deviendrait-elle évidente que quand elle interagit avec un système immun atopique ?

L’exposé comporte quatre parties :

• Les familles de protéines.
• La superfamille des cupines.
• La superfamille des Bet-v 1-like.
• La superfamille des prolamines.

– Les familles de protéines

De même que l’on classe les êtres vivants en familles (par exemple la famille botanique des Bétulacées), de même peut-on classer les protéines en familles (par exemple la famille des PR-10).

L’équipe autrichienne, et en particulier Christian Radauer, est à l’origine d’AllFam (http://www.meduniwien.ac.at/allerge...), un logiciel en ligne qui vous permettra d’accéder à toutes sortes d’informations concernant les protéines (JACI 2008, 121 :847).

Les 181 allergènes alimentaires d’origine végétale appartiennent tous à seulement 35 familles sur les 9318 que recense la base de données Pfam (environ 0.38%).

Sur ces 35 familles, quatre contiennent 66% de tous les allergènes alimentaires d’origine végétale connus (Jenkins JA ety al, JACI 2005, 115 :164).

Si l’on classe par ordre d’importance les familles contenant le plus grand nombre d’allergènes :

• Superfamille des prolamines
• Profilines
• Tropomyosines
• EF hand domain
• Superfamille des cupines
• Expansines, domaine C terminal
• Protéines reliées à Bet-v 1
• Lipocalines
• PR-1 protéines
• Subtilisin-like serine protéase
• Trypsine-like serine protease
• Caséines
• Expansines, domaine N terminal
• Serum albumines
• Thaumatin-like proteins

– La superfamille des Cupines.

Il y a au moins 18 familles fonctionnelles différentes, enzymatiques et non-enzymatiques.

Les membres de ces diverses familles varient très largement en séquences mais sont tous caractérisés par une caractéristique structurelle de base, comprenant une structure en baril avec deux hélices béta (Dunwell 1998).

Les cupines :

• Le terme cupines (cupa, en latin, signifie baril) a été donné à un domaine à structure de baril-béta pour identifier ces protéines (un exemple : la protéine germin-like de l’orge).

• Les monocupines incluent un seul domaine cupine soit au centre d’une protéine simple, soit en tant qu’un domaine parmi d’autres dans une protéine plus complexe (Germines).

Les monocupines, ou cupines à un seul domaine constituent la majorité des cupines.

Elles sont soit mono-, soit di-, soit oligomériques.

• • Les monocupines monomériques :

La batérie Klebsiella pneumoniae exprime une dioxygénase monomérique qui devint l’archétype d’une nouvelle famille de protéines, les ARD (acireductone dioxygénases).

Les ARD représentent une branche clé dans la voie de survie de la methionine de la bactérie

• • Les monocupines dimériques :

L’archée thermophile Pyrococcus furiosus produit une phosphoglucose isomérase homodimérique.

Cette enzyme glycolytique unique fait preuve d’une grande thermostabilité avec une température optimale de plus de 90°C.

Une autre archée thermophile, Methanobacterium thermoautotrophicum exprime une dTDP-4-déhydro-rhamnose 3,5-épimérase.

Cette enzyme homodimérique est impliquée dans la biosynthèse de dTDP-L-rhamnose, un composant de la paroi cellulaire de l’archée.

• • Les monocupines oligomériques :

Les protéines germines et les germine-like (GLPs) sont des monocupines oligomériques et représentent la plus importante famille de cupines chez les plantes.

Les germines du blé et de l’orge sont des Oxalates oxydases homohexamériques hautement thermostables.

On peut citer quelques exemples de germines allergéniques : Cit s 1 (orange) Pip n Germin (Poivre noir) et Tri a Germin (Blé)

• Les bicupines ont évoluées à partir de la duplication puis de la fusion d’un domaine ancêtre simple(7S et 11S protéines globulaires de stockage des graines).

La découverte des bicupines chez les procaryotes a montré que ces protéines ont évoluées à partir d’une duplication puis fusion d’un gène procaryotique d’un seul domaine ancestral.

Par exemple, l’oxalate décarboxylase de Bacillus subtilis.

Les bicupines trimériques : les globulines 7S vicilin-like (Béta-conglycinine du soja)

Exemples de vicilines allergéniques : Ara h 1 (arachide), Len c 1 (Lentille), Pis s 1 (pois), Béta-conglicinine alpha SU (soja), Ana o 1 (noix de cajou), Jug r 2 (noix) Ses i 3 (graines de sésame).

Les bicupines hexamériques : 11S legumin-like globulines. Chaque sous unité comprend un polypeptide acide lié à un polypeptide basique.

Les 11S globulines existent sous la forme d’un mélange de trimères et d’hexamères.

Exemples de légumines allergéniques :Ara h 3, 4 (arachide), chaîne acide de la glycinine SU G1 (soja), chaîne basique de la glycinine SU G1-G5 (soja), Ana o 2 (noix de cajou), Ber e 2 (noix du Brésil), Cor a 9 (noisette) et Jug r 4 (noix).

En dépit de leur large distribution, la grande majorité des allergènes des cupines appartiennent soit aux vicilines-like, soit aux légumines-like, toutes deux incluses dans le groupe des protéines de stockage des graines.

Ils comprennent les allergènes majeurs des légumes, des fruits à coque et des graines.

– La superfamille des Bet v 1-like.

Elle comporte 11 familles :

• Famille Bet v 1
• Phosphatidyl-inositol transfer protéines
• Domaine START
• Domaine AHA1
• Ring hydroxylases alpha chain
• Polyketide cyclases
• SMU440-reliées
• CalC-reliées
• PA1206-reliées
• Famille CoxG
• Ring hydroxylases homotrimériques.

Des homologues structuraux de Bet v 1 existe chez des bactéries et des archées !...

La famille Bet v 1 comporte, elle, plusieurs sous familles :

• Dicot PR-10
• Monocot PR-10 type I
• Monocot PR-10 type II
• Conifer PR-10
• CSBP (Cytokinin specific binding proteins)
• Norcoclaurine synthases
• Protéines majeurs du latex/RRP
• Moss PR-10
• Plant polyketide cyclase-like/Bet v 1 sub-family
• Bacterial Bet v 1- related minor group.

Il y a une grosse difference entre ceux à quoi on est exposé (Dicot PR-10, Monocot PR-10 type II, CSBP, Protéines majeurs du latex/RRP) et les allergènes…

Peu de choses sur les fonctions sinon une grande variété de ligands (hormones, métabolites secondaires,…).

– La superfamille des prolamines

Les protéines membres ont peu d’identité de séquence mais partage une structure similaire.

Cette superfamille a été identifiée en premier par Kreis et ses collaborateurs en 1985.

Elle a été principalement définie par un squelette commun : C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-Cxn-C.

Ce squelette de cystéine a été également trouvé chez les prolamines des céréales et dans toute une gamme de petites protéines riches en sulfures.

Les membres de cette superfamille appartiennent presque exclusivement aux plantes à fleurs.

Des protéines reliées aux 2S albumines sont présentes dans les spores de quelques fougères.

La superfamille des prolamines comprend 9 familles dont on rappelle les fonctions :

• Prolamines des céréales : protéines de stockage des graines.
• Alpha amylase/trypsin inhibitor : inhibe des enzymes digestives d’insectes.
• nsLTP1 : Transfert de phospholipides in vitro, transfert de monomères de cutine, antimicrobien. (la plupart des allergènes des LTP appartiennent à cette famille là).
• nsLTP2Transport de monomères de subérine.
• 2S albumines : protéines de stockage des graines, antifungique, antibactérien
• Puroindoline : antifungique in vitro.
• Hydrophobic protein : fonction inconnue.
• Alpha globulines : protéines de stockage des graines
• Hydroxyproline rich protein : composants des parois cellulaires des plantes.

Les distributions de ces 9 familles concerne l’endosperme des graines, les pollens, les fruits, et des tissus variés (Hydroxyproline rich protein).

C’est une superfamille différente des autres superfamilles en ce sens qu’elle comporte un nombre élevé d’allergènes (présents dans toutes les familles à l’exception de Hydroxyproline rich protein)

Voyons quelques exemples d’allergènes de la superfamille des prolamines :

• Prolamines des céréales : Tri alpha gliadine, tri gamma gliadine, Tri a LMW gluténine.
• AA/TI :Hor v 15, Tri a AA/TI, Ory s AA/TI.
• nsLTP1 : Amb a 6, Par j 1, Pla a 3, Pru p 3, Zea m 14, Pru av 3, Cor a 8.
• nsLTP2 : Bra r nsLTP2
• 2S albumines : Ara h 2, Ber e 1, Jug r 1, Ana o 1.
• Hydrophobic protein : Gly m 1.
• Puroindoline : Tri a puroindoline-a, Tri a puroindoline-b.
• Alpha globulines : Tri a alpha globuline.

– Conclusions

La vision évolutive de la biologie des allergènes nous permet de voir les protéines allergéniques dans leur contexte évolutif.

Les allergènes sont limités à quelques familles de protéines.

Le but de la vision évolutive de la biologie des allergènes est d’étudier l’origine des allergènes dans l’espoir de découvrir l’émergence de l’allergénicité elle-même.

Progrès en diagnostic des allergies alimentaires : comment utiliser des molécules allergéniques en clinique.

Adriano Mari

Première remarque :épidémiologie et diagnostic sont des notions qui appartiennent à des contextes tout à fait différents :

Quand on parle d’épidémiologie, on parle d’un groupe d’individus.

Quand on parle de diagnostic, on parle d’un seul individu.

Deuxième remarque : les extraits allergéniques et les allergènes, ce n’est pas la même chose !

Certains extraits ne contiennent pas certains allergènes, mais quand on utilise des extraits, on utilise quelque chose dont on ne connaît pas la composition.

Donc des allergènes plutôt que des extraits ; par ailleurs les allergènes recouvrent des concepts qui vont au-delà des sources allergéniques et au-delà de l’allergie alimentaire.

En effet certains extraits commerciaux de noisette ont été analysés et la présence de certains allergènes connus et caractérisés comme les LTP apparaît comme aléatoire…

De plus, selon les process appliqués aux matières premières, on a une grande variation du contenu : par exemple dans les extraits de crevettes on observe une grande variations des résultats en SDS-PAGE selon les modes de cuisson appliqués.

On doit commencer par l’évocation du problème des réactivités CCD, capables de perturber complètement les résultats des tests (Mari et al, JACI 1999).

Même si l’on suppose ce problème réglé, le niveau d’IgE spécifique n’est pas corrélé au risque clinique.

Un autre problème lié aux extraits est que la faible concentration en certains allergènes ne donne pas une image exacte de l’IgE réactivité du patient ; cet inconvénient disparaît complètement si on utilise des allergènes individuellement.

L’utilisation de microarrays (chips) permet de préciser l’IgE réactivité vis-à-vis de plusieurs dizaines d’allergènes.

D’une façon générale, avant de dire qu’une protéine n’est pas allergénique, il faudrait avoir testé des millions de personnes…

Les modes d’expositions sont d’une importance pratique évidente : vous pouvez être en contact avec du lyzozyme en mangeant des œufs, en buvant du vin ou en prenant des médicaments…

En conclusion, Adriano Mari défends l’utilisation des allergènes plutôt que des extraits (ce qui donnera lieu un peu plus tard à un débat contradictoire « pro&con » dans le cadre du congrès)

Ses principaux arguments sont que les allergènes vont au delà des sources allergéniques et de l’allergie alimentaire : ce qui compte, c’est une image aussi fidèle que possible de l’IgE réactivité du sujet. Mais cette image (les résultats des chips) devra être interprétée, ce qui n’est pas une mince affaire dans l’état actuel de nos connaissances…

En attendant on peut dresser un tableau des sévérités des réactions cliniques en fonction des allergènes :

CCD, profilines, Bet v 1-like, LTP sont classés dans le sens d’une sévérité croissante.

Les tests de provocation ne s’envisageront pas avec les CCD, on pourrait en discuter pour les profilines, et on pourrait les envisager avec les Bet v 1-like et les LTP, mais avec quelles préparations ?

Dans le schéma de base de l’allergie IgE-médiée, on peut avoir une absence de sensibilisation et d’allergie, on peut avoir une sensibilisation (définie par la présence d’IgE) avec ou sans allergie (IgE + symptomes)

Il apparaît clairement que les IgE ne suffisent pas à expliquer la clinique : il nous manque un maillon dans l’explication, mais lequel ?

A.Mari suggère de considérer le rapport des patients symptomatiques aux patients asymptomatiques.

Allergènes moléculaires des plantes.

Javier Cuesta-Herranz

Javier Cuesta-Herranz est coordonateur de la Vegetalia Network Fundacion.

L’étude Vegetalia est une étude multicentrique (11 centres ont participé) menée en Espagne et qui nous offre une image extrêment riche du paysage épidémiologique au niveau des allergènes et non plus des produits.

900 patients ont été inclus par 9 groupes d’allergologues.

Chaque groupe d’allergologues a inclus 100 patients : 50 allergiques au pollen sans allergie alimentaire et 50 patients allergiques à n’importe quel aliment d’origine végétale, avec ou sans pollinose.

Un algorithme de diagnostic d’allergie alimentaire a été mis au point, faisant intervenir des tests de provocation selon les critères classiques.

Le panel de testing cutané ne présente pas de particularités notables : il est plus interessant de s’attarder sur le panel moléculaire :

Pollens :

Pariétaire, nPar j 1
Cupressus, nCup s 1
Olea, nOle e 1, nOle e 9 (N+C domaine glucanase)
Graminées, nPhl p 1, nCyn d 1, nPhl p 5.
Plantago, nPla l 1
Chenopodium, rChe a 1, rChe a 3
Salsola, nSal k 1
Platanus, rPla a 1 + nPla a 2
Artemisia, nArt v 1

Aliments d’origine végétale :

Farine de blé, nCM3+nCM16 (inhibiteur alpha amylase)
Lentille, nLen c 1 (viciline)
Pêche, rPru p 3
Chitinase, nPrs a 1 + rCas s 5
Moutarde, nSin a 1 (2S albumine)

Aliments d’origine végétale et pollens :

Mélange de profilines, rChe a 2, rMal d 4, rCuc m 2
PR-10, nBet v 1 + rMal d 1
nPeroxydase (CCD)

Au total, 28 molécules purifiées (n ou r), 9 extraits de pollens et 16 extraits d’aliments d’origine végétale pour les tests cutanés.

Sur les 900 patients : 450 patients allergiques à des aliments d’origine végétale et 450 polliniques.

Plus de 50 000 tests cutanés et plus de 36 000 analyses in vitro ont été réalisées.

Dans le groupe des allergies aux aliments végétaux, la proportion des patients présentant une pollinose est d’environ 62%.

Les résultats des tests IgE des patients du groupe pollinose vis-à-vis des allergènes majeurs des pollens : (les pourcentages sont approximatifs)

• Phl p 1, 66%
• Ole e 1, 47%
• Cup s 1, 34%
• Pla l 1, 9%
• Pla a 1y2, 12%
• Art v 1, 11%
• Bet v 1, 3%
• Par j 1, 3%
• Sal k 1, 11%

a-t-on mis en évidence des différences selon les origines géographiques des patients ?

• Pamplona : pas de réactivité notée à Ole e 9, forte proportion de patients répondant à Phl p 1, 5, Cyn d 1 Ole e 1. Environ 18% de réactions à Cup s 1.
• Madrid était assez comparable
• Barcelone offrait une meilleure répartition des réactivités
• Pour Jaen, le paradis des oliviers, 36% de réactivité à Ole e 9 et 82% à Ole e 1.
• Elche : on peut noter 70% de réactivité à Sal k 1.

Au total, il y avait donc d’importantes différences au niveau moléculaire selon l’origine géographique des patients mais ces différences géographiques sont également retrouvées parmi plusieurs protéines contenues dans le même extrait !

L’allergie au pollen présente-t-elle des caractéristiques particulières selon que le patient est allergique ou pas à certains aliments d’origine végétale ? En d’autres termes la présence d’une allergie alimentaire doit elle modifier la prise en charge d’une allergie pollinique ?

Chez les allergiques aux aliments, on trouve nettement plus de pourcentage de réactivité vis-à-vis du plantain, du platane de l’armoise, du bouleau, de la pariétaire et de la soude. Les pourcentages sont similaires pour les Graminées, l’olivier et les cyprès.

D’un point de vue moléculaire, on retrouve des différences significatives pour Bet v 1, Pla a 1y2, Sal k 1, Profilines, Pru p 3 et Len c 1 chez les allergiques alimentaires.

Autrement dit on retrouvait une importante augmentation de la fréquence des réponses positives aux pollens, même pour des pollens non présents dans l’atmosphère.

Au niveau moléculaire, on retrouvait une augmentation statistiquement significative pour Pru p 3, Profilines, Sal k 1, PR-10, Pla a 1+2 et Len c 1.

La fréquence de l’asthme chez les polliniques (avec ou sans allergie alimentaire) était de 52%.

Ce pourcentage tombe à 47% chez les polliniques sans allergie alimentaires et monte à 59% pour les polliniques avec allergie alimentaire.

Au niveau moléculaire peu de changements : les profilines situées au deuxième rang en fréquence chez les allergiques alimentaires passe au quatrième rang tandis que Sal k 1 reste au 3e rang.

50% d’asthme pour les patients négatifs pour les profilines et 73% chez les patients positifs pour les profilines.

Les polliniques avec allergie alimentaire ont donc une fréquence d’asthme plus élevée.

La sensibilisation aux profilines était associée à une fréquence d’asthme plus élevée.

En dépit de différences géographiques observées dans les pollinoses, la pêche, le melon et le kiwi étaient les aliments les plus fréquemment en cause en allergie alimentaire dans toutes les zones géographiques.

Conclusion :

Il existe une relation entre les allergies aux pollens et aux aliments végétaux.

30% des allergies aux aliments d’origine végétale n’étaient pas des polliniques.

Il y avait des sensibilisations asymptomatiques aux profilines et aux LTP.

L’allergie alimentaire (aliments végétaux) était associé à une plus grande sévérité de la pollinose.

La sensibilisation aux profilines était associé aux OAS en allergie alimentaire et à une plus grande sévérité de la pollinose (asthme).

La sensibilisation aux LTP était associée à une plus grande fréquence de réactions systémiques, notamment pour les patients non polliniques.

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Les aliments : amis ou ennemis ?

Vaste session consacrée aux allergies alimentaires à travers trois exposés traitant des aspects épidémiologiques, moléculaires et thérapeutiques de cette question.

Profils cliniques de l’allergie alimentaire à travers l’Europe.

Monserrat Fernandez-Rivas

Monserrat Fernandez-Rivas ne s’est pas livré à une revue de la littérature : les données présentées ici sont tirées d’EuroPrevall, une étude transversale multicentrique, prospective, qui a démarré à l’automne 2005 et qui est toujours en cours.

– Méthode :

• La sélection des patients : réaction allergique à n’importe quel aliment survenant dans un délai inférieur à 2 heures.
• Bilan : histoire clinique, tests cutanés et biologie en CAP système.
• Des tests de provocations en double aveugle contre placebo ont également été réalisés.

N’ont été retenus que les patients avec une histoire clinique évocatrice et, au minimum, des tests cutanés positifs.

Les patients avec des tests cutanés ou des IgE négatives mais présentant un test de provocation positif n’ont pas été pris en compte.

– Les aliments étudiés :

• Les aliments les plus importants : lait, œuf, poisson, crevette, arachide, noisette, céleri, pomme et pêche.
• Les autres aliments étudiés : noix, kiwi, soja, sésame, blé, moutarde, tomate, carotte, banane, melon, graines de tournesol, lentilles, graines de pavot, maïs et sarrasin.

Au total, 1822 patients étudiés, dont 61% de femmes, et une répartition non linéaire de ces patients selon les différents pays :

• Bulgarie 8,5%
• République Tchèque 4,3%
• France 7,7%
• Grèce 9,1%
• Islande 5,7%
• Italie 5,4%
• Lituanie 11,4%
• Pays bas 5,8%
• Pologne 13,5%
• Espagne 10,3%
• Suisse 16,1%
• Royaume uni 2,3%

– les résultats :

Si l’on regarde les aliments en cause selon les tranches d’âges :
– Avant 3 ans :

• Œuf 32,7%
• Lait 16,4%
• Poisson 7%
• Arachide 6,4%
• Noisette 3,5%
• Pomme 1,8%
• Noix 1,8%
• Pêche 1,8%
• Kiwi 1,8%
• Sésame 1,2%
• Céleri 1,2%
• Carotte 0,6%
• Moutarde 0,6%
• Soja 0,6%
• Blé 0,6%
• Tournesol 0,6%
• Pavot 0,6%
• Lentille 0,6%

– De 3 à 14 ans, par ordre de fréquence : noisette, arachide, pomme, noix. Emergence des aliments d’origine végétale.

– Après 14 ans : deux aliments sont nettement plus souvent en cause : noisette et pomme. Viennent ensuite arachide, noix, pêche, carotte, céleri.

Les données qui suivent se rapportent exclusivement à ce groupe de patients âgés de plus de 14 ans.

Les groupes cliniques sont partagés en trois sous-groupes :

• Seulement un syndrome oral (OAS)
• OAS et autre chose
• Pas d’OAS

Quand on étudie la clinique en fonction des aliments en cause, on note qu’avec la crevette et le poisson, on retrouve moins de syndromes oraux qu’avec les aliments d’origine végétale.

Avec les aliments d’origine végétale, on rencontre plus d’allergies respiratoires associées.

Dans les aliments en cause dans l’anaphylaxie, on retrouve les attendus arachide (8,9%) et céleri ( 8,3%), on en trouve peu avec la pomme (1,1%), mais un aliment est particulièrement retrouvé : ce sont les graines de tournesol (15,6%), plus fréquemment en cause que les autres aliments.

Les aliments en cause sont-ils les mêmes dans tous les pays ? (Nous nous limiterons au top 5)

• Bulgarie : arachide, pêche, kiwi, pomme, noisette
• République Tchèque : noisette, pomme, arachide, pêche, carotte
• France : pomme, noisette, pêche, carotte, arachide
• Grèce :noix, pêche, arachide, noisette, tournesol
• Islande : crevette, poisson, kiwi, pomme, arachide
• Italie : pomme, noisette, pêche, tomate, noix
• Lituanie : noisette, pomme, arachide, carotte, noix
• Pays bas : pomme, noisette, arachide, noix, tomate
• Pologne : noisette, pomme, céleri, carotte, arachide
• Espagne : pêche, melon, crevette, kiwi, arachide
• Suisse : noisette, pomme, carotte, arachide, céleri
• Royaume uni : arachide, noisette, pomme, noix, kiwi

Les aliments les plus fréquemment en cause sont la pomme et la noisette, sauf dans trois pays :

• En Islande, crevette et poisson sont en tête.
• En Espagne, c’est la pêche et le melon.
• En Grèce, la noix et la pêche.

Si l’on examine les particularités aliment par aliment :

• Noisette et noix : on a d’avantage de réactions systémiques en Grèce, par exemple, ce qui indique que l’allergie à la noisette n’est pas la même partout…
• Arachide : pas de syndrome oral en Islande.

On peut donc distinguer des pays de la zone méditerranéenne (Grèce, Espagne) et des pays du Nord de l’Europe, tandis que l’Italie se comporte tantôt comme les premiers tantôt comme les seconds.

• Pêche, céleri, tomate, melon : on a surtout des OAS en France, ce qui est différent de la Suisse…
• Crevette : plus de réactions systémiques et moins d’OAS.
• Graines de tournesol : 70% de réactions systémiques en Grèce, Pologne et Lituanie, et pourtant, cet aliment ne fait pas partie de la directive européenne.

Il est à noter que pour les autres pays, le tournesol ne représente à peu près rien.

– Conclusion :

• L’allergie alimentaire est variable en Europe en terme de prévalence des aliments en cause et de la sévérité des symptômes cliniques.
• Pour tenter de trouver une explication à ces disparités, il faut, selon Monserrat Fernandez-Rivas faire appel à un jeu complexe d’interactions entre :
  • l’individu (facteurs génétiques, atopie, tractus gastro-intestinal, barrière cutanée, hyperréactivité bronchique, age, sexe, réponses aux parasites, statut nutritionnel)
  • les aliments (Contenu en allergènes, process appliqués, voies d’exposition, profil d’exposition, quantité)
  • l’environnement (allergènes aéroportés, habitudes alimentaires, habitudes culinaires, microbes et parasites).

Abord des bases moléculaires de l’allergie alimentaire.

Barbara Ballmer-Weber, Suisse

L’enquête EuroPrevall nous a appris que les allergènes d’origine végétale étaient en tête, ce qui incite à se rappeler que l’Europe (plus particulièrement l’Europe du Nord) coïncide avec la zone d’influence du pollen de bouleau.

On peut distinguer :
– Des allergies alimentaires primaires : lait, œuf, blé, poisson, crevette, arachide, soja et fruits à coque (tree nuts), qui sont plutôt sévères.
– Des allergies alimentaires reliées aux pollens : Fruits, légumes, fruits à coque (nuts), qui sont plutôt modérées.

L’abord moléculaire est un moyen simple d’appréhender la complexité de l’allergie alimentaire en plusieurs étapes.

• Evaluation des profils d’IgE réactivité au niveau individuel.
• Corrélation de ces profils et des situations cliniques.
• Marqueurs de sévérité clinique
• Différences géographiques des profils d’IgE réactivité.

L’exemple du kiwi :

• Originaire de Chine (chinese gooseberry), le kiwi est cultivé en Nouvelle-Zélande depuis 1937.
• C’est en 1952 que les premiers plants ont été exportés vers l’Europe et c’est depuis 1975 environ que le kiwi y est consommé.
• A Zurich, la prévalence de l’allergie au kiwi a régulièrement augmenté de 87 à 98 puis explose littéralement depuis cette date.

– 35 patients avec une histoire clinique d’allergie au kiwi ont été étudiés, dont 30 ont subis un test de provocation en double aveugle contre placebo.
– Les sujets contrôles présentaient une allergie au pollen de bouleau (5), au latex (5) ou étaient non atopiques (5).
– 100% des patients présentaient un syndrome oral et 23% des vomissements, dyspnée ou chute tensionnelle.
– Sur les 30 sujets retenus, 8 étaient monosensibilisés, 17 présentaient également une pollinose au bouleau et 5 une allergie au latex.

Regardons les pourcentages d’IgE-réactivité pour les allergènes étudiés pour le diagnostic moléculaire dans l’étude EuroPrevall :

• nAct c 1, actinidine : 20%
• nAct c 2, thaumatine like : 10%
• nAct d 3, nouvel allergène de 40 kDa : 33%
• nAct d 4, cystatine : 20%
• nAct d 5, kiwelline : 20%
• nAct d 8, Bet v 1 like : 43%
• nAct d profiline : 20%

Aucun allergène majeur selon la définition classiquement admise.

Le kiwi se trouve à l’origine de plusieurs types de réactions :

• pollen-kiwi : rAct d 8 (53%), Profiline (24%)
• Latex-kiwi : Chitinase de classe I, LTP ?
• Monosensibilisés au kiwi : nAct c 1, l’actinidine (63%)

Où l’on voit que, si l’on considère les sous-groupes de l’allergie au kiwi, on peut mettre en évidence des allergènes majeurs.

En conclusion,

• le kiwi est un nouvel aliment allergénique, important et fréquemment en cause.
• Il n’y a pas d’allergènes majeurs mais des allergènes majeurs spécifiques de sous groupes.
• Le kiwi comporte un homologue de Bet v 1 (Act d 8).
• L’actinidine est un marqueur potentiel de sévérité des réactions cliniques.

L’exemple de la noisette est intéressant car EuroPrevall nous a appris l’importance de cet aliment en matière d’allergie alimentaire en Europe :

182 patients se répartissant en :

• 57 patients allergiques à la noisette ; test de provocation en double aveugle contre placebo (DBPCFC) et anaphylaxie.
• 62 allergiques aux pollens de bouleau ou d’olivier (OFC négatif)
• 63 sujets non atopiques.

Pour les allergènes :

• rCor a 1.04, Bet v 1 like
• rCor a 2, « Bet v 2 like »
• rCor a 8, LTP
• rCor a 9, légumine
• rCor a 11, viciline
• nCor a Bd8K, viciline

Les deux premiers allergènes sont reliés au pollen de bouleau et pas les suivants.

Cliniquement, on a 100% d’OAS, mais des variations selon les centres, avec par exemple 41% de réactions sévères en Espagne.

In vitro on a une forte réactivité vis-à-vis des LTP en Espagne et une forte réactivité vis-à-vis de Bet v 1 dans le Nord de l’Europe.

On a donc beaucoup de syndromes oraux (OAS) dans le nord correspondant aux Bet v 1 like, et plus de réactions systémiques dans le sud, correspondant aux LTP.

Le cas du soja (étude EU-FAREDAT) :
– Le soja est un nutriment important dans le monde, classiquement à l’origine d’allergies alimentaires, mais encore mal connu.
– Il n’y a (pour le moment) que deux allergènes officiellement acceptés dans le soja.
– Entre Gly m 4 et Bet v 1, il n’y a que 48% d’identité de séquence (Mittag et al, JACI 2004) ce qui explique que le soja ne se comporte pas comme la pomme ou la noisette vis-à-vis des polliniques au bouleau, et ce n’est pas une question de dose…
– Le soja est impliqué dans des allergies alimentaires primaires (il y a beaucoup d’urticaires, d’angioedèmes, d’asthme et d’hypotension) et dans des allergies alimentaires reliées aux pollens.
– Dans la distinction des réactions systémiques sévères et des réactions modérées, les odds ratio sont inférieure à 1 pour Gly m 4, de 5 pour la béta-conglycinine et de 12 pour la béta-conglycinine / glycinine (Holzhauser et al, soumis à la publication).

Chez 59 patients allergiques au soja (36 adultes et 23 enfants) la prévalence de l’IgE réactivité vis-à-vis de la béta-conglycinine est de 44%.

Schéma général :
– Du nord au sud, les OAS diminuent en fréquence, les réactions systémiques augmentent, les IgE réactivités vis-à-vis des PR-10 diminuent, tandis qu’elles augmentent pour les LTP et les protéines de stockage. Peu de changement pour les profilines selon l’axe nord-sud.
– En passant de Mal d 1, Pru av 1 et Cor a 1 à Api g 1 puis Gly m 4, les OAS diminuent en fréquence tandis que les réactions systémiques augmentent alors que les PR-10 restent stables.
– En passant de Gly m 4 à la béta-conglycinine on a de moins en moins d’OAS et de plus en plus de réactions systémiques.

Nouvelles stratégies thérapeutiques en allergie alimentaire.

Hugh Sampson

Des nouveaux traitements en allergie alimentaire ?

Fichtre, ça n’est pas rien et en plus, le sujet est traité par un des papes de l’allergologie pédiatrique… Voilà qui est un rien excitant !

Toutes les promesses sont elles faites pour être tenues ? Vous jugerez par vous-même…

Ce qu’on fait actuellement, c’est l’éducation.

Pour faire bref, ça ne marche guère, tout au moins aux USA où l’orateur appuie là où ça fait mal :

En effet, selon Ross et al, JACI 2008 :

• 125 000 consultations par an pour allergie alimentaire.
• 15 000 pour anaphylaxie
• 3100 hospitalisations
• 150 morts

Les nouvelles approches thérapeutiques

• Immunothérapies spécifiques
  • Immunothérapie orale (OIT)
  • Immunothérapie sublinguale (SLIT)
  • Alimentation en protéines dénaturées thermiquement
  • Protéines recombinantes
• Immunothérapies non spécifiques
  • Immunothérapie anti-IgE
  • Médications à base d’herbes chinoises

Immunothérapie orale :

Quelques études, dont une en 2004.

Dans cette étude, 15/21 (71%) enfants allergiques au lait désensibilisés sur une période de 6 mois (6.8 mg de protéines par jour) (Meglio et al, Allergy 2004).

Résultats : 36% de non répondeurs et 28% de répondeurs partiels ou non.

Plus récemment, étude de Longo et al, JACI 2008 :

60 enfants, qui ont tous présentés des effets secondaires.

Résultats après un an : 36% de désensibilisés, 54% de résultats partiels et 10% d’abandon pour cause de réactions.

SLIT

Etude de Enrique et al, JACI 2005

22 sujets allergiques à la noisette.

Dans le sous-groupe traité, 5 sur 7 ont toléré 20g de noisette.

On notait également une augmentation des IgG4 et de l’IL-10, ainsi qu’une diminution des IgE.

Ces études doivent tenir compte du fait que 80 à 85% des enfants ne sont plus allergiques au lait ou à l’oeuf spontanément tandis que ces chiffres tombent à 15-20% pour l’arachide, les fruits à coque et les produits de la mer.

On devrait donc plutôt dire que environ 80% des enfants allergiques au lait ou à l’œuf répondent à OIT ou SLIT.

Plusieurs phénotypes sont proposés par H.Sampson :

• Type I : Allergie transitoire (bonne réponse à OIT)
• Type II : allergie prolongée (Réponse partielle à OIT)
• Type III : allergie persistante (Ne tolèrent pas OIT)
• Type IV : Oral allergy syndrom (OAS) par réactivité croisée.

Etude sur le lait dénaturé thermiquement.

On a observé des diminutions des tests cutanés, des IgE et une augmentation des IgG4 ainsi que des effets au niveau des T reg : OIT naturelle ?

Recombinants :

Ara h 1, 2 et 3 ont été testés sur des souris avec une diminution des sIgE et des IL4, 5 et 13.

Anti-IgE :

Ce n’est pas le *Xolair qui a été testé…

25% ont amélioré leur seuil.

Herbes chinoises :

Ces médications traditionnelles chinoises se sont avéré assez efficaces, mais sans effet durable. Une nouvelle cure a de nouveau été efficace.

Essai de prévention :

Introduction précoce de barres à l’arachide chez des enfants israéliens…

– Conclusion :

• Il est vrai que des effets positifs de diverses thérapeutiques ont pu être mis en évidence mais s’agit-il de désensibilisation ou de tolérance ?
• Les études pour les anti-IgE sont en phase I et preuve de principe, tandis que les thérapeutiques chinoises sont en phase I.

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Réactivités croisées en diagnostic allergologique.

Adriano Mari et Danila Zennaro.

Cette forme de session est une innovation de l’EAACI.

Associant un orateur senior expert et un orateur junior, cette session d’1H30 nécessitant une inscription préalable, est entièrement dédiée à une mise au point sur un thème allergologique, sans chercher à mettre en avant d’éventuelles nouveautés mais en s’attachant à traiter en profondeur les différents aspects de la problématique.

La forme choisie privilégie le dialogue entre les orateurs, les questions de l’assistance interrompant les orateurs à tout moment, dans une interaction voulue en temps réel.

Un polycopié est distribué aux participants et un espace de 10’ est ménagé à la fin de la séance où l’assistance répond à un questionnaire QCM.

Adriano Mari, à la tête du centre d’allergologie clinique et expérimentale IDI-IRCCS de Rome, initiateur du site de référence « allergome » et par ailleurs secrétaire du groupe d’intérêt diagnostic allergologique de l’EAACI était « La » personne pour traiter du sujet choisi.

Ses coordonnées : a.mari@panservice.it ou adriano.mari@allergome.org

Introduction :

A la base, les maladies allergiques sont dues à la reconnaissance par les IgE d’une protéine ou d’une glycoprotéine, l’allergène, généralement inoffensive pour la population générale.

Les allergènes sont définis par leur propriété extrinsèque de se lier aux IgE.

Les allergènes peuvent être classés en différentes familles de protéines.

Il est intéressant de constater qu’ils semblent appartenir à un nombre restreint de ces familles en comparaison avec toutes les protéines connues à ce jour.

Une exposition répétée à l’allergène est un prérequis à la sensibilisation (réponse immune primaire) et pour les réactions allergiques qui vont suivre (réponse immune secondaire).

En fait, on peut décrire trois étapes qui conduisent à une maladie allergique au cours desquelles différentes cellules sont impliquées.

• Les allergènes doivent d’abord être reconnues par les cellules naïves T et B pour l’initiation de la réponse.
• Ensuite un contact avec des cellules mémoires T et B conduira à la production d’IgE spécifiques de l’allergène.
• La troisième étape, c’est le contact entre l’allergène et les IgE des mastocytes ou basophiles sensibilisés débouchant sur les symptômes cliniques.

Seule la première de ces trois étapes est déterminée par un allergène unique.

Les deuxièmes et troisième étapes peuvent être induites par des composants identiques ou similaires.

C’est le contexte général des réactivités croisées, une notion essentielle en allergologie.

Le but de ce cours pratique est d’explorer l’histoire du concept des « réactivités croisées », d’introduire le nouveau terme de « co-reconnaissance » à travers la re-définition des ressources de base de son évaluation.

Le concept nouvellement défini devrait conduire le lecteur à une meilleure interprétation des tableaux cliniques des maladies allergiques, d’une façon plus ancrée dans l’immunologie.

Définition de base :

La réactivité croisée est la relation directe IgE-médiée entre des sources allergéniques et des molécules appartenant à des familles taxonomiques identiques, proches ou distantes.

Etude de la réactivité croisée :

– Les études épidémiologiques :

Beaucoup d’études ont identifié la réactivité croisée entre différentes sources uniquement à partir de données épidémiologiques et cliniques.

L’observation d’un haut niveau de co-réactivité, définie comme des tests positifs à différents composants au même moment chez le même patient, entre des espèces taxonomiquement proches a conduit des allergologues à conférer à cette « preuve » épidémiologique le rôle d’observation de base pour commencer à parler de « réactivité croisée ».

L’accumulation de ce genre de données au fil du temps et l’observation de différentes populations ont partiellement confirmé l’observation initiale.

On peut dire que ces études ont été utiles mais qu’elles ont parfois été trompeuses.

Une étude sur la pollinose a été menée à Florence en 1952.

• Ses auteurs, Serafini et Gorla, ont tenté de préciser la prévalence des sensibilisations aux pollens de 74 familles botaniques chez 1343 sujets.
• Trois familles taxonomiques (Graminées ; Urticacées et Astéracées) sont nettement plus fréquemment en cause que les autres, dont la fréquence est comparable.
• L’image des prévalences que donne cette étude n’est que très parcellaire, ne concernant que la région de Florence. Une seule étude ne peut suffire…

En augmentant le nombre de tests que l’on applique à ces études basées sur des populations, on récolte plus d’exceptions que de clarifications du problème.

– Les études cliniques :

Un autre niveau, principalement basé sur l’observation clinique de patients singuliers a été plus contributif pour notre connaissance du phénomène de « réactivité croisée ».

Le test de transfert passif de Prausnitz-Küstner : Prausnitz était allergique au poisson. Une IDR avec du sang de Prausnitz a été faite chez Küstner. Quand ce dernier a ingéré du poisson, il y a eu réactivation locale au niveau de l’IDR.

En 1983, ce test a encore été utilisé : on a utilisé du sérum (HBs négatif) d’un donneur allergique au pollen de bouleau et on a observé des réponses vis-à-vis du céleri, de la pomme, etc…

Ce test est un vieux test, qui ne peut plus être réalisé pour des raisons évidentes de sécurité, mais c’est la seule façon d’objectiver en clinique une réactivité croisée.

La présence de symptômes dès la première exposition à un organisme donné ou à ses tissus, sans contact préalable à l’un quelconque de ses allergènes, est la preuve clinique la plus importante suggérant un phénomène de réactivité croisée.

De telles conditions ne sont malheureusement pas aussi fréquentes qu’on le pense généralement.

Des expositions limitées ou cachées à de nombreuses sources allergéniques ne peuvent être complètement exclues que ce soit par l’allergologue ou par son patient.

En pratique courante, tout ce qu’on a, ce sont des réponses multiples aux tests cutanés, à des pollens présents dans l’environnement ou non.

On se limite donc à une simple constatation, sans explication.

– L’approche immunologique :

Une étape de plus vers une définition plus fiable de la « réactivité croisée » a été atteinte après la découverte des IgE par des méthodes immuno-chimiques appliquées aux extraits allergéniques.

Bien qu’ils n’étaient et, finalement, ne sont toujours pas caractérisés en terme de contenu spécifique en protéines, l’immunochimie a apporté et continue d’apporter une vision préliminaire des relations immunologiques IgE-médiées entre des organismes allergéniques.

Cela n’a malgré tout pas permis de répondre à quelques uns des problèmes majeurs car les outils des techniques de laboratoire étaient et sont toujours insuffisamment pointues.

L’application de la biochimie moderne dès le début des années 80, suivie par la révolution de la biologie moléculaire constitue le point de départ de la définition réelle du concept de « réactivité croisée ».

Matériel, méthodes et procédures :

– Matériel : les extraits.

Historiquement, les premiers matériaux utilisés pour étudier les réactivités croisées ont été les extraits allergéniques ; les premiers extraits allergéniques remontent à 1916.

Les extraits sont obtenus par la collecte soigneuse des sources ou de leurs tissus, en veillant à éviter toute contamination par des sources ou des tissus étrangers.

Les protocoles établis pour l’obtention de protéines visent à obtenir une fraction du matériel source contenant généralement des protéines, au mieux contenant toutes les molécules allergéniques.

Les procédures d’extraction peuvent être différentes selon le statut du composant allergénique à l’intérieur des tissus de l’organisme.

Après presque un siècle dédié aux préparations d’extraits allergéniques, et après plusieurs essais pour obtenir de façon standard des matériaux reproductibles, la meilleure définition applicable aux extraits reste « un mélange imprévisible de protéines allergéniques et non allergéniques ».

On rappellera par exemple qu’avec du lait de la même vache, on obtiendra au fil des jours des extraits tout à fait variables en contenu allergénique.

Si on fait des tests cutanés avec des cerises provenant de différentes régions, on obtiendra des extraits différents.

Autre problème : avec le chat, on ne peut pas extraire tout le chat…Personne ne sait quoi choisir exactement.

Des extraits ne comportant pas de composants allergéniques pertinents ou contenant des allergènes non reliés à la source d’origine sont encore une réalité d’aujourd’hui.

Une liste complète des sources allergéniques étudiées sous la forme d’extraits est disponible sur www.allergome.org.

Un immunoblot d’un extrait de pollen de pariétaire montre une large bande pouvant en réalité contenir 4 molécules : Bref, il faut des molécules !

- Matériel : les molécules.

L’utilisation du terme « allergène » ne devrait concerner que la définition de structures moléculaires contenues dans des organismes, extraites et isolées par des techniques biochimiques, immuno-chimiques ou de biologie moléculaire bien définies.

Les molécules allergéniques sont obtenues sous forme de mélanges à l’intérieur d’extraits allergéniques.

Si elles sont purifiées à partir de sources naturelles, elles peuvent être présentes dans la préparation sous forme de mélange d’isoformes naturels.

Si elles sont obtenues par clonage d’un gène dans un organisme hétérologue, elles sont généralement purifiées sous la forme d’un isoforme unique.

La molécule isolée peut subir une caractérisation physique et biochimique.

La séquence primaire d’acides aminés est l’information de base en matière d’identification d’une molécule allergénique.

Une nomenclature officielle est attribuée aux molécules allergéniques par le sous comité pour la nomenclature des allergènes, émanation de l’organisme OMS-IUIS (www.allergen.org).

La liste la plus complète de molécules allergéniques est disponible sur www.allergome.org.

– Matériel : les épitopes.

Les épitopes, structures sous moléculaires définies par 5 à 10 acides aminés, sont impliquées dans la liaison avec les anticorps spécifiques.

Il n’y a pas de caractéristique intrinsèque pour qu’une structure biochimique soit reconnue fonctionnellement comme épitope.

Leur nature est définie par un anticorps, l’IgE, et se trouve donc être une caractéristique extrinsèque.

C’est l’anticorps qui joue le rôle majeur dans la définition de reconnaissance de l’épitope sur les molécules.

Les épitopes peuvent également être définis comme la structure basique définissant une molécule comme étant un antigène.

Une molécule portant ses propres épitopes non retrouvés sur d’autres molécules peut être regardée comme le sensibilisateur primaire.

Cette condition est difficile à démontrer car le sujet allergique est la plupart du temps exposé à plusieurs allergènes homologues ; il faudrait pouvoir disposer de tous les allergènes homologues pour obtenir un résultat fiable.

Il y a deux types d’épitopes : linéaire ou séquentiel et conformationnel ou structurel.

Les épitopes linéaires sont définis par une chaîne d’acides aminés de 5 à 10 unités correspondant à 100% à une séquence présente dans la structure primaire de la molécule protéique.

Les épitopes conformationnels sont des zones de la surface de la molécule où se lie l’anticorps, mais les acides aminés formant l’épitope ne sont pas distribués séquentiellement à l’intérieur de la séquence primaire de la protéine.

Une fois que la structure tertiaire de la protéine est détruite par dénaturation (par exemple par chauffage), les épitopes conformationnels sont perdus.

La seule manière d’étudier des épitopes conformationnels est d’obtenir de courtes séquences d’acides aminés mimant la structure de la surface ; on les appelle des mimotopes.

Extraits allergéniques, molécules et épitopes sont tous des « composants ».

– Méthodes : tests cutanés.

Les tests cutanés sont la méthode la plus sensible et la plus rapide pour tester un composant allergénique, que ce soit un extrait ou une molécule, quant à son activité biologique dans le système « naturel » que constitue l’individu allergique.

Ils peuvent être utilisés en diagnostic individuel et dans des études de populations importantes.

Les données épidémiologiques collectées jusqu’à présent suggèrent quelques relations entre les composants allergéniques testés.

Aucune procédure expérimentale ne peut être appliquée en utilisant des tests cutanés.

Les tests cutanés sont généralement appliqués comme des tests multiples et sont donc par là les premières approches multiplex du diagnostic allergologique.

La composition variable du panel des composants allergéniques est à l’origine de résultats disparates en regard des données cliniques.

– Méthodes : Détection IgE en approche singleplex.

Depuis la découverte des IgE, leur détection a été partie intégrante des développements des méthodes diagnostiques, mais leur détection a aussi constitué la base d’étude des relations mutuelles entre les composants allergéniques.

Ceci a été rendu possible par le développement d’anticorps anti-IgE monoclonaux et polyclonaux hautement spécifiques.

La phase solide, utilisée par la plupart des systèmes testant les IgE, ou les phases liquides utilisées par quelques uns ont été développés pour porter des préparations uniques (c’est-à-dire un extrait allergénique).

Plusieurs molécules allergéniques ont été rendues disponibles par ces systèmes singleplex.

Ils permettent de conclure à la présence ou à l’absence d’IgE polyclonales spécifiques pour le composant testé, même pour des molécules allergéniques.

Les systèmes singleplex ont été largement utilisés à des fins expérimentales pour définir les relations immunologiques entre composants isolés.

– Méthodes : détection des IgE par approche multiplex.

La mise à disposition de systèmes microarrays pour des études génomiques, adaptés en microarrays protéomiques par adjonctions de spots d’antigènes nous ont permis d’approcher certains problèmes immunologiques de façon différente.

Les composants allergéniques sont testés ensemble, sur la même surface.

Ils sont distincts les uns des autres soit par couplage à des micro perles fluorescentes, soit par leur position ponctuelle sur une surface vitrée.

La détection des IgE est rendue possible avec des quantités très limitées (quelques picogrammes) de composants allergéniques.

Il est ainsi possible de réaliser des tests IgE multiples sur une surface ou un volume très réduits.

Ces micro dimensions permettent également de réduire à l’extrême la quantité de sérum et d’anticorps anti-IgE nécessaire (de l’ordre du microlitre).

Avec ce qu’il faut pour faire 1 CAP, on peut faire environ 500 patients en chips…

Ils permettent de conclure à la présence ou à l’absence d’IgE polyclonales spécifiques du composant allergénique testé, au mieux une molécule allergénique.

La détection d’IgE au moyen d’immunoblot peut être considérée comme une approche multiplex, puisque plusieurs composants (molécules) d’un extrait peuvent être discriminées et testées pour leur liaison IgE après séparation par électrophorèse sur gel polyacrylamide sodium-dodécyl sulphate (SDS-PAGE).

Le principal facteur limitant est l’absence d’identification des bandes séparées.

– Procédures : inhibition, cf Palazzo et al, 2007.

La procédure d’inhibition est réalisée en phase liquide.

Pour évaluer les relations immunologiques entre deux composants, un composant (B) est mélangé à un échantillon de sérum contenant une IgE spécificité connue pour le composant A.

Si le composant B porte des spécificités présentes sur le composant A, les IgE spécifiques du composant A seront bloquées.

Le mélange sérum et composant B est alors testé par un système d’IgE détection comportant le composant A et seules les IgE libres vont se lier au composant A dans le système.

– Procédures : adsorption (ou déplétion) cf Palazzo et al, 2007.

Bien que rarement utilisé, ce système demeure la meilleure approche méthodologique pour étudier les relations des composants à d’autres composants.

La différence avec la procédure d’inhibition repose sur une étape préalable où le composant B est couplé à une phase solide de façon covalente, généralement à un polymère de cellulose.

L’échantillon de sérum dont la spécificité vis-à-vis de A est connue est ajouté à l’antigène lié au polymère.

Si le composant B porte des spécificités présentes dans le composant A, les IgE spécifiques du composant A vont rester liées à la phase solide.

L’excédent de sérum est collecté et testé par un système de détection d’IgE comportant le produit A ; les IgE libres restantes, s’il y en a, vont se lier au composant A.

L’avantage de l’adsorption réside sur la complète séquestration des IgE de l’échantillon à tester pour l’allergène.

Tant avec l’inhibition qu’avec la déplétion, on peut tester extraits avec des extraits, des extraits avec des molécules et des molécules avec des molécules.

– Résultats expérimentaux et diagnostics combinant matériaux, méthodes et procédures.

Dans les quatre paragraphes suivants, le premier composant (A) est sur phase solide, et le deuxième est l’inhibiteur (B). Les conditions sont celles d’un excès d’inhibiteur.

– Extraits vs extraits.

Pendant très longtemps, les extraits ont été les seuls réactifs utilisés dans l’étude des réactivités croisées.

Adsorption ou inhibition en systèmes singleplex ont été les méthodes et procédures utilisées pour obtenir les résultats.

Comme ils dépendaient largement des spécificités des échantillons de sérums, les résultats étaient souvent une combinaison entre l’interaction de nombreuses molécules en même temps soit du côté de l’extrait, soit du côté du sérum.

Des résultats significatifs étaient obtenus le plus souvent quand un sérum, prévu pour reconnaître une ou quelques bandes, était testé en inhibition d’un extrait pas très riche en molécules allergéniques.

Dans le cas d’extraits allergéniques complexes ayant des composants multiples reconnus par des IgE poly-spécifiques, les résultats étaient imprévisibles et, la plupart du temps ininterprétables.

Au fur et à mesure de l’usage de l’inhibition en immunoblot, on a atteint une meilleure compréhension puisque l’inhibition de la liaison IgE d’une bande spécifique pouvait être constatée.

La sensibilité de la technique immunoblot, la co-migration de protéines et les spécificités des sérums sont de toutes manières des obstacles à l’obtention de résultats rationnels.

Un résultat diagnostic peut être trompeur et la relation entre organismes non reliés immunologiquement peut être possible.

– Extraits vs molécules.

En système singleplex, la molécule en tant qu’inhibiteur souffre des mêmes limitations et des mêmes imprédictibilités des résultats que la méthode d’inhibition extrait vs extrait.

Plusieurs résultats possibles peuvent être largement dépendant des compositions de l’extrait et des spécificités des sérums.

Le test d’inhibition en immunoblot apporte une importante amélioration puisque l’inhibition spécifique d’une molécule peut se traduire par la disparition d’une simple bande.

Les limitations par phénomène de co-migration restent toujours présentes.

Les relations immunologiques entre les extraits et les molécules peuvent conduire à une meilleure définition des profils d’IgE-réactivité.

– Molécules vs extraits.

La présence de molécules reliées dans l’inhibiteur, bloquant l’IgE réactivité, donne des résultats pertinents en terme de présence de la molécule dans l’extrait.

La réalisation d’une courbe d’inhibition pourrait également aider à définir une concentration de façon semi quantitative dans l’extrait.

En répétant cette inhibition par l’extrait vis-à-vis de plusieurs molécules, on en arrive à caractériser l’extrait en terme de contenu en allergènes.

Dans cette optique, les systèmes multiplex de détection d’IgE permettent de faire la même chose en gagnant du temps pour un moindre coût.

Le résultat diagnostic est à son meilleur niveau et les limitations sont pour la plupart liées à la composition de l’extrait.

– Molécules vs molécules.

En combinant mol/mol en approche multiplex, on atteint la manière la plus fine de décrire les relations entre organismes sur la base de la reconnaissance par les IgE d’épitopes partagés.

En fait, en raison de la forte quantité de chaque composant qui est nécessaire en général pour les tests d’inhibition, les expériences d’inhibition à ce niveau sont souvent limitées à quelques molécules contre une seule.

La mise à disposition de panels d’allergènes sur des microarrays permet des inhibitions multiples en utilisant une seule molécule comme inhibiteur.

Le résultat diagnostic est valable et nécessite seulement d’être vérifié au niveau clinique.

IgE réactivité croisée ou IgE co reconnaissance ?

La compréhension du concept d’IgE co-reconnaissance est une question immunologique et clinique.

La meilleure manière de définir une relation d’organisme à organisme est de définir dans quelle mesure les IgE peuvent se lier à des épitopes présents chez une ou plusieurs protéines présentes dans les tissus.

L’utilisation de « réactivité croisée » devrait être limitée au cas où le sensibilisateur primaire est connu, ce qui est un cas particulier du concept de co-reconnaissance.

Définition finale.

La réactivité croisée allergique est basée sur une reconnaissance par les IgE.

Deux allergènes sont cross-réactifs s’il existe un seul anticorps IgE qui réagit avec les deux.

C’est pourquoi la meilleure définition d’un tel phénomène est une co-reconnaissance par les IgE, puisque c’est l’anticorps qui définit en premier la nature de la molécule.

Application à 4 cas cliniques :

– C = conjonctivite, A = asthme et R = rhinite
– M = masculin, F= féminin
– SIT = immunothérapie spécifique

-	Patient n°1	Patient n°2	Patient n°3	Patient n°4
Sexe et âge	M, 28 ans	M, 27 ans	F, 43 ans	F, 54 ans
Clinique	CR	CRA	CRAO	CRA
Bouleau	neg	neg	+++	+++
Noisetier	neg	neg	+++	+++
Gram	++	+++	+++	+++
Genévrier	neg	neg	neg	+++
Armoise	neg	neg	neg	+++
Olivier	neg	neg	+++	+++
Pariétaire	neg	neg	+++	+++
Plantain	neg	neg	neg	+++
Aliments	neg	neg	+++	neg

Grâce aux chips, on connaît les molécules impliquées.

• Patient n°1 : 1 molécule impliquée (Groupe 1 des Gram) SIT indiquée
• Patient n°2 : 4 molécules impliquées (Groupe 1, 2, 4 et 5 des Gram) SIT indiquée
• Patient n°3 : 4 molécules impliquées également (Par j 2, Ole e 1, Groupe 1 des Gram, Bet v 1 like) SIT sera peut être indiquée dans le futur ?...
• Patient n°4 : SIT non indiquée mais pourtant une seule molécule impliquée (polcalcines) SIT peut être indiquée dans le futur ?...

Nous n’avons peut être pas besoin de molécules, mais au moins de savoir la composition des extraits…

Autre conséquence pratique, en rupture avec nos habitudes : on ne connaît pas l’agent sensibilisateur, donc ON NE PEUT PAS parler de source allergénique …

Question de la salle : les laboratoires pharmaceutiques sont-ils prêts à afficher la composition de leurs extraits ?

Réponse d’Adriano Mari : « Les laboratoires pharmaceutiques sont toujours prêts à vendre leur produit, mais c’est aux médecins de dire le lien qu’ils veulent entre la science et la pratique. Actuellement, les sociétés pharmaceutiques essayent d’adapter les gens à leurs problèmes : ce devrait être l’inverse et ça, ça dépend de nous, les praticiens. »

PS : les lecteurs soucieux de parfaire leurs connaissance en allergologie peuvent m’adresser un mail et je leur ferai parvenir le questionnaire QCM de 10’ qui a clôturé cette session (dr.hervecouteaux@wanadoo.fr).

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